犬肝射頻消融后移行區(qū)PET/CT表現(xiàn)與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子表達(dá)的相關(guān)性

杜小麗，暢智慧，王傳卓，劉兆玉，崔鵬

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院放射科，沈陽(yáng) 110004）

近年來(lái)，射頻消融（radiofrequency ablation， RFA）迅速發(fā)展，逐漸成為臨床上有效治療肝臟惡性腫瘤的一項(xiàng)非外科手術(shù)療法［1］，尤其是小肝癌［2］。但RFA術(shù)后腫瘤的殘留和復(fù)發(fā)率相對(duì)較高［3］，在治療肝臟腫瘤時(shí)，RFA治療安全區(qū)域應(yīng)超過(guò)腫瘤邊緣1.0 cm，以提高腫瘤滅活率［4］。因此，腫瘤周邊（移行區(qū)）的正常肝組織也會(huì)受到熱損傷。已有大量關(guān)于影像學(xué)評(píng)價(jià)RFA治療肝臟腫瘤療效的報(bào)道，其中PET/CT集形態(tài)學(xué)及功能學(xué)于一體而優(yōu)勢(shì)明顯，但熱損傷的肝組織與殘余腫瘤在18F FDG-PET/CT上均可出現(xiàn)高代謝，導(dǎo)致鑒別困難［5～7］。組織損傷后會(huì)有一個(gè)修復(fù)過(guò)程，其中不僅有多種修復(fù)細(xì)胞參與，還有許多生長(zhǎng)因子在這一過(guò)程中發(fā)揮重要作用。目前認(rèn)為，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）通過(guò)影響與其相應(yīng)的血管內(nèi)皮上的受體來(lái)促進(jìn)血管通透性的增加和血管的增生，促進(jìn)肉芽組織的形成，在介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移及組織修復(fù)中起重要作用［2，8，9］。深入研究移行區(qū)肝組織在修復(fù)過(guò)程中的代謝機(jī)制，將有助于與殘余腫瘤鑒別。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察犬肝組織RFA術(shù)后移行區(qū)PET/CT表現(xiàn)及VEGF的表達(dá)情況，探討移行區(qū)肝組織PET/CT表現(xiàn)特點(diǎn)及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備和材料

消融設(shè)備為北京為爾福電子公司生產(chǎn)的WE-7568多極射頻腫瘤消融儀和WHK-8型多極針消融電極（由母針1枚、子針10枚構(gòu)成，子針完全展開(kāi)成扁球型，最大直徑5 cm）。CT與PET/CT掃描均使用GE公司生產(chǎn)的Discovery ST-16 PET/CT一體機(jī)，PET掃描示蹤劑由GE Mini-Tracer回旋加速器生產(chǎn)（示蹤劑為18F-FDG，放射性純度＞95%），圖像分析在Xeleris工作站上完成。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

本實(shí)驗(yàn)符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)，已通過(guò)中國(guó)醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。選成年健康雜種犬15只，雌雄不拘，體質(zhì)量15～20 kg，所有實(shí)驗(yàn)犬均由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動(dòng)物部提供。每次行RFA及影像檢查前，實(shí)驗(yàn)犬禁飲食12 h；PET/CT檢查前監(jiān)測(cè)血糖，確保實(shí)驗(yàn)犬在行PET/CT檢查時(shí)的血糖值在正常范圍內(nèi)（血糖過(guò)高或過(guò)低可能會(huì)影響肝臟對(duì)18F-FDG的攝?。?。實(shí)驗(yàn)全程使用聯(lián)合麻醉，速眠新（鹽酸二氫埃脫啡、氟哌啶醇、保定寧合劑）0.1～0.15 mL/kg肌肉注射行全身麻醉，戊巴比妥鈉10 mg/kg增加麻醉效果。術(shù)中根據(jù)情況追加速眠新，劑量為首次劑量的1/3～1/2。

按隨機(jī)數(shù)字表法將15只犬分成5組，每組3只，對(duì)每只犬肝臟行2次RFA治療，共得到30個(gè)消融灶。根據(jù)RFA術(shù)后行影像檢查時(shí)間的不同，將實(shí)驗(yàn)組命名為即刻組、1周組、2周組、4周組和8周組。即刻組：RFA治療后2 h內(nèi)行PET/CT掃描，完成檢查后將犬處死，取肝臟病理；1周組：RFA治療后，將犬送回動(dòng)物部常規(guī)飼養(yǎng)，1周后行PET/CT掃描，完成檢查后將犬處死、取病理；依此類推，2周組、4周組和8周組分別是RFA治療后將犬飼養(yǎng)2周、4周和8周再行PET/CT掃描，完成檢查后將犬處死、取病理。

1.3 RFA

每次RFA均在CT引導(dǎo)下實(shí)施，將犬的雙前肢及肝區(qū)備皮，仰臥，外電極固定于雙前肢。肝區(qū)鋪定位紙，CT平掃定位后選擇合適的體表穿刺點(diǎn)（有意選擇遠(yuǎn)離肝包膜、肝門區(qū)及大血管分支的肝實(shí)質(zhì)），常規(guī)碘伏消毒，將射頻電極分別穿刺入肝左、右葉，展開(kāi)電極子針，直徑2 cm，進(jìn)行RFA治療。設(shè)定射頻發(fā)生器治療溫度90℃，脈沖頻率290 kHz，每個(gè)治療區(qū)消融10 min，消融過(guò)程中功率逐漸上升，最大輸出功率為200 W。術(shù)后連續(xù)3 d肌肉注射青霉素抗炎（80萬(wàn)U/d）。

1.4 PET/CT掃描

以5 Mbq/kg的劑量沿預(yù)先安置的套管針注射18F-FDG，注藥后將犬安放在安靜、避光的房間，60 min后開(kāi)始采集圖像。PET采用3D掃描模式，采集1個(gè)床位，時(shí)間3 min。圖像經(jīng)衰減校正，采用有序子集最大期望值法進(jìn)行重建。

1.5 PET/CT圖像分析

PET/CT影像由1名放射科醫(yī)師與1名核醫(yī)學(xué)科醫(yī)師進(jìn)行評(píng)估。整個(gè)過(guò)程采用盲法（醫(yī)生各自閱片，互不交流），分析各組犬肝臟的PET/CT表現(xiàn)并測(cè)量30個(gè)消融灶移行區(qū)的標(biāo)準(zhǔn)攝取值（standardized uptake value，SUV），每個(gè)指標(biāo)測(cè)量3次，結(jié)果取平均值。具體方法：選取消融灶最大截面及其上、下臨近層面，在每個(gè)層面的移行區(qū)勾畫3個(gè)直徑2～4 mm的小圓形興趣區(qū)（region of interest，ROI），避開(kāi)大血管，盡量避開(kāi)消融灶中心壞死區(qū)及周圍正常肝組織，測(cè)量其SUV。

1.6 組織病理學(xué)檢查

每組實(shí)驗(yàn)犬完成規(guī)定的影像檢查后被處死（沿預(yù)先安置在股靜脈的套管針注射10%氯化鉀溶液30 mL，使其心臟停跳而死亡），剖腹取治療后的肝臟組織進(jìn)行病理檢查。橫斷切開(kāi)凝固壞死灶及與之相鄰的正常肝組織，行HE染色。取移行區(qū)肝組織行ELISA法測(cè)定VEGF含量。

1.7 測(cè)定VEGF含量

采用雙抗體夾心ELISA法測(cè)定肝組織VEGF含量。以抗大鼠VEGF單抗包被于酶標(biāo)板上，移行區(qū)肝組織勻漿上清液中的VEGF與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗鼠VEGF，形成免疫復(fù)合物連接在板上，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Streptavidin與生物素結(jié)合，加入酶底物鄰苯二胺，出現(xiàn)黃色，加稀硫酸終止反應(yīng)。在492 nm處測(cè)吸光度（A）值，VEGF濃度與A值成正比，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中VEGF濃度（陽(yáng)性對(duì)照為標(biāo)準(zhǔn)品，陰性對(duì)照采用無(wú)VEGF的標(biāo)準(zhǔn)品）。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用Pearson相關(guān)分析，P＆lt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RFA結(jié)果

15只實(shí)驗(yàn)犬均成功行RFA手術(shù)，術(shù)后犬恢復(fù)良好，無(wú)手術(shù)并發(fā)癥。本研究對(duì)15只犬的30個(gè)消融灶進(jìn)行評(píng)估與分析。

2.2 各組PET/CT與病理表現(xiàn)

即刻組、1周組、2周組及8周組消融灶PET/CT圖像（圖1）均表現(xiàn)為18F-FDG低代謝，1周組、2周組消融灶周圍可見(jiàn)環(huán)形FDG高代謝區(qū)，由內(nèi)向外依次為低－高－等代謝（圖1B、1C）；4周組 PET/CT表現(xiàn)與1周組相似。即刻組病理表現(xiàn)：3層帶狀結(jié)構(gòu)，中央?yún)^(qū)為早期凝固壞死的肝組織，呈嗜酸性染色，肝細(xì)胞分解，小葉及肝索結(jié)構(gòu)破壞；中間移行帶表現(xiàn)為肝竇擴(kuò)張、充血，殘留的肝細(xì)胞萎縮；外帶肝細(xì)胞反應(yīng)較輕，可見(jiàn)水腫及空泡樣變性，細(xì)胞核多正常（圖2A）。2周組病理表現(xiàn)：凝固壞死的肝組織細(xì)胞核模糊，周圍可見(jiàn)肝竇局灶性擴(kuò)張、充血，大量中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，少量纖維組織形成（圖2B）。8周組病理表現(xiàn)：中央?yún)^(qū)為壞死的肝組織，外周纖維組織增生明顯，其內(nèi)可見(jiàn)慢性炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2C）。

圖1 各組犬肝臟RFA術(shù)后PET/CT表現(xiàn)Fig.1 The image of PET/CT after RFA in canine liver in all groups

圖2 各組犬肝臟RFA術(shù)后病理表現(xiàn)Fig.2 The pathology after RFA in canine liver in all groups

2.3 VEGF含量與SUV值相關(guān)性分析

每組移行區(qū)肝組織平均VEGF水平與平均SUV 值呈顯著相關(guān)（r=0.933，P＆lt;0.05），見(jiàn)圖3。

3 討論

隨著RFA技術(shù)的不斷發(fā)展，在臨床腫瘤治療等領(lǐng)域中也得到了廣泛的應(yīng)用，RFA的原理是通過(guò)高溫產(chǎn)生熱損傷，使組織細(xì)胞發(fā)生凝固性壞死［7］。目前對(duì)RFA在臨床應(yīng)用的療效報(bào)道較多，但對(duì)RFA術(shù)后正常組織修復(fù)過(guò)程的特點(diǎn)鮮有報(bào)道。正常肝組織會(huì)對(duì)RFA熱損傷產(chǎn)生一系列炎性反應(yīng)，在PET/CT上多表現(xiàn)為壞死灶周圍組織的高代謝，而大部分惡性腫瘤亦有上述影像表現(xiàn)，因此這種炎性反應(yīng)嚴(yán)重影響了腫瘤殘留或復(fù)發(fā)的準(zhǔn)確判斷［10］。組織損傷后會(huì)有一個(gè)修復(fù)過(guò)程，其中不僅有多種修復(fù)細(xì)胞參與，還有許多生長(zhǎng)因子在這一過(guò)程中發(fā)揮重要作用。目前認(rèn)為，VEGF通過(guò)影響與其相應(yīng)的血管內(nèi)皮上的受體來(lái)促進(jìn)血管通透性的增加和血管的增生，促進(jìn)肉芽組織的形成，在介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移及組織修復(fù)中起重要作用［2，8，9］。鑒于此，研究肝組織 RFA 后移行區(qū)不同時(shí)間點(diǎn)VEGF表達(dá)，將有助于了解移行區(qū)組織修復(fù)的過(guò)程，并與PET/CT表現(xiàn)對(duì)照，為鑒別腫瘤殘留或復(fù)發(fā)提供理論依據(jù)。并且有研究結(jié)果表明，血清及肝組織中VEGF水平高，肝臟RFA術(shù)后預(yù)后較差［11］。

圖3 各組犬肝RFA術(shù)后移行區(qū)組織SUV值與VEGF表達(dá)的相關(guān)性分析Fig.3 The correlation analysis of SUV and VEGF expressionsafter RFA in canine liver in all groups

本研究結(jié)果表明，PET/CT可反映犬肝臟RFA術(shù)后不同時(shí)期病理變化，移行區(qū)VEGF的表達(dá)與SUV值變化具有一定的相關(guān)性。RFA術(shù)后超急性期（即刻組）消融灶中央的凝固壞死導(dǎo)致血液流出道受阻、肝竇擴(kuò)張充血，PET/CT上未出現(xiàn)代謝變化，表現(xiàn)為等代謝，VEGF濃度與SUV值均接近正常肝組織。此后，炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)和肉芽組織的形成使組織代謝增高，PET表現(xiàn)高代謝，VEGF濃度與SUV值逐漸增高；隨著肉芽組織逐漸成熟，代謝程度也隨之減低，VEGF濃度與SUV值逐漸降低；肉芽組織被纖維組織代替后（8周組），代謝接近正常肝組織，VEGF濃度與SUV值也恢復(fù)到正常肝組織水平（圖1、2）。

本研究小組之前的研究證實(shí)肝臟惡性腫瘤患者RFA后早期復(fù)查PET/CT（24 h內(nèi)）可避開(kāi)炎性反應(yīng)干擾、準(zhǔn)確評(píng)價(jià)消融效果，但存在假陽(yáng)性病例［6，8，10］，并主張肝臟腫瘤RFA治療后2 h內(nèi)復(fù)查PET/CT，以便更早、更準(zhǔn)確地判斷RFA效果。正常肝組織對(duì)射頻損傷產(chǎn)生的炎性反應(yīng)一般持續(xù)4周左右，表現(xiàn)為消融灶周圍組織的高代謝，在這期間正常肝組織的炎性反應(yīng)在PET/CT上的表現(xiàn)會(huì)對(duì)準(zhǔn)確判斷是否存在腫瘤殘余造成干擾。術(shù)后4周，尤其到術(shù)后8周時(shí)，PET/CT受炎性反應(yīng)的干擾均較小。對(duì)于術(shù)后8周影像復(fù)查，PET/CT掃描將不受炎性反應(yīng)干擾。經(jīng)本研究相關(guān)分析顯示，SUV值與VEGF的表達(dá)顯著相關(guān)（圖3），且 Veit等［12］研究顯示殘余灶平均SUV值為8.7（7.7～10.5），顯著高于移行區(qū)，監(jiān)測(cè)肝臟腫瘤患者血漿VEGF濃度可能將有助于評(píng)價(jià)RFA治療效果，但腫瘤殘存組織PET/CT表現(xiàn)與VEGF的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。隨著分子影像學(xué)的發(fā)展，已有關(guān)于VEGF及其受體顯像的研究報(bào)告，利用分子影像手段，通過(guò)監(jiān)測(cè)VEGF表達(dá)來(lái)評(píng)價(jià)RFA治療肝臟腫瘤療效將是未來(lái)發(fā)展的趨勢(shì)。

從上述分析可以看出，犬正常肝組織RFA術(shù)后，熱損傷的肝組織經(jīng)過(guò)一個(gè)有序的修復(fù)過(guò)程，VEGF在修復(fù)過(guò)程中有著重要的作用，并與PET/CT表現(xiàn)存在一定的相關(guān)性。本研究不足之處：（1）移行區(qū)較薄，對(duì)比測(cè)量其SUV值影響較大，并且無(wú)法排除部分容積效應(yīng)的影響；（2）正常肝組織RFA術(shù)后的病理修復(fù)和PET/CT表現(xiàn)及VEGF的表達(dá)，還是有別于肝癌等病理組織RFA后的變化，在臨床工作中肝臟惡性腫瘤伴（或不伴）肝硬化背景下這些因素可能會(huì)對(duì)射頻效果產(chǎn)生影響，影像特點(diǎn)可能與正常肝組織消融有所不同，相應(yīng)的病理變化也可能存在差異。為能更準(zhǔn)確地判斷臨床腫瘤RFA治療后的變化，還有待對(duì)肝癌的RFA術(shù)后的變化做進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

［1］Cammà C,Di Marco V,Orlando A,et al.Treatment of hepatocellular carcinoma in compensated cirrhosis with radio-frequency thermal ablation（RFTA）：a prospective study［J］.J Hepatol,2005,42（4）：535-540.

［2］Waki K,Aikata H,Katamura Y,et al.Percutaneous radiofrequency ablation as first-line treatment for small hepatocellular carcinoma：results and prognostic factors on long-term follow up ［J］.J Gastroenterol Hepatol,2010,25（3）：597-604.

［3］Maier-Hein L,Tekbas A,Seitel A,et al.In vivo accuracy assessment of a needle-based navigation system for CT-guided radiofrequency ablation of the liver［J］.Med Phys,2008,35（12）：5385-5396.

［4］鄒立秋,郭輝,杜端明,等.射頻毀損后正常兔肝臟CT與病理變化的相關(guān)性研究［J］.中國(guó)醫(yī)學(xué)影像技術(shù),2008,24（1）：17-19.

［5］Veit P,Antoch G,Stergar H,et al.Detection of residual tumor after radiofrequency ablation of liver metastasis with dualmodality PET/CT：initial results［J］.Eur Radiol,2006,16（1）：80-87.

［6］暢智慧,劉兆玉,等.18F-FDG PET、CT及PET/CT對(duì)肝臟惡性腫瘤射頻消融術(shù)后殘余瘤診斷的分析［J］.中國(guó)臨床醫(yī)學(xué)影像雜志,2010,21（11）：774-777.

［7］Goldberg SN,Charboneau JW,Dodd GD 3rd,et al.Image-guided tumor ablation：proposal for standardization of terms and reporting criteria［J］.Radiology,2003,228（2）：335-345.

［8］劉兆玉,暢智慧,盧再鳴,等.肝臟惡性腫瘤射頻消融術(shù)后PETCT早期復(fù)查的臨床價(jià)值［J］.中華放射學(xué)雜志,2009,43（11）：527-530.

［9］范仲凱,谷艷婷,曹陽(yáng),等.VEGF121轉(zhuǎn)染對(duì)誘導(dǎo)后血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響［J］.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2010,39（8）：628-631.

［10］劉兆玉,王傳卓,暢智慧,等.正常犬肝臟射頻消融后CT、正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)體層成像-CT與病理表現(xiàn)的比較［J］.中華放射學(xué)雜志,2009,44（11）：436-441.

［11］Poon RT,Lau C,Pang R,et al.High serum vascular endothelial growth factor levels predict poor prognosis after radiofrequency ablation of hepatocellular carcinoma：importance of tumor biomarker in ablative therapies［J］.Ann Surg Oncol,2007,14（6）：1835-1845.

［12］Veit P,Antoch G,Stergar H,et al.Detection of residual tumor after radiofrequency ablation of liver metastasis with dual-modality PET/CT：initial results［J］.Euro Radiology,2006,16（1）：80-87.