柴胡皂苷d對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞一氧化氮及JNK磷酸化水平的影響

李妍，紀(jì)朋艷，彭順利，張巍，呂士杰，何哲

（吉林醫(yī)藥學(xué)院1.生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室；2.生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室；3.臨床醫(yī)學(xué)院；4.藥學(xué)院，吉林 吉林 132013）

柴胡是我國(guó)的傳統(tǒng)中藥，始載于《本經(jīng)》，按性狀及生長(zhǎng)地理位置的不同又分為北柴胡和南柴胡［1］。柴胡性味苦，微寒，歸肝膽實(shí)經(jīng)，中醫(yī)認(rèn)為其具有升陽(yáng)舉氣、軀散退熱、疏肝解郁等功效，在臨床上常用于治療頭痛目眩、寒熱往來、口苦耳聾、胸滿肋痛、月經(jīng)不調(diào)、子宮下垂等癥［2］。柴胡所含化學(xué)成分較多，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)或提取的有效成分有柴胡皂苷（Saikosaponin，SS）、揮發(fā)油、黃酮、多元醇、脂肪酸、多糖等成分，其主要活性成分為SS及揮發(fā)油?，F(xiàn)已從柴胡屬植物中分離出90多種齊墩果烷型皂苷類成分。研究發(fā)現(xiàn)，SS具有廣泛的藥理作用，如抗癌、抗炎、抗病毒、鎮(zhèn)靜、止痛等。根據(jù)SS化學(xué)結(jié)構(gòu)的差異，可分為 SSa、SSb、SSc、SSd 等，其中 SSd 的生物學(xué)活性最強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)以人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞為研究對(duì)象，在前期的研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步觀察了SSd對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)基中一氧化氮（nitric oxide，NO）含量的影響，并觀察了SSd預(yù)處理后細(xì)胞JNK蛋白磷酸化水平的改變，以期對(duì)SSd抑制腫瘤細(xì)胞增殖的相應(yīng)機(jī)制進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系及主要試劑：SH-SY5Y細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院；SSd，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；胎牛血清，元亨生物科技有限公司產(chǎn)品；DMEM高糖培養(yǎng)基，美國(guó)Hyclone公司生產(chǎn)；DMSO，購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠；NO檢測(cè)試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品；JNK及p-JNK抗體，美國(guó)Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品；ECL化學(xué)發(fā)光劑，碧云天生物技術(shù)研究所生產(chǎn)。

1.1.2 儀器：細(xì)胞培養(yǎng)箱，北京東方安若生化科技有限公司生產(chǎn)；超凈臺(tái)，蘇州凈化儀器廠產(chǎn)品；酶標(biāo)儀，購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加拿大JET公司生產(chǎn)；96孔板，美國(guó)Cornning公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)：SH-SY5Y細(xì)胞株接種于無菌培養(yǎng)瓶中，加入DMEM高糖培養(yǎng)基（含體積分?jǐn)?shù)為10%的滅活胎牛血清，100 U/mL青霉素及100 U/ml鏈霉素），置于體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶底面積80%之后傳代，傳代時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化2～3 min，再以培養(yǎng)基吹打制成細(xì)胞懸液后重新接種。

1.2.2 SSd藥物配制：我們的先期實(shí)驗(yàn)篩選了溶解SSd的溶劑DMSO的無毒作用濃度，發(fā)現(xiàn)0.1%～0.4%的DMSO對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞生長(zhǎng)增殖沒有明顯影響［3］，故將SSd標(biāo)準(zhǔn)品粉末溶于含0.3%DMSO的DMEM高糖培養(yǎng)基，0.22微孔濾膜過濾除菌，使SSd在DMEM高糖培養(yǎng)基中的終濃度分別為0（對(duì)照組）、4、8、10 μmol/L。

1.2.3 SSd對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)基中NO含量的影響：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞，吸棄其細(xì)胞培養(yǎng)液，用0.25%胰酶消化后按3×104/mL接種于24孔板中，常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，給予溶于0.3%DMSO的不同濃度SSd。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，取出培養(yǎng)板，按照碧云天生物技術(shù)研究所NO檢測(cè)試劑盒說明書測(cè)定各組培養(yǎng)基中NO含量，每個(gè)樣本均設(shè)8個(gè)平行組。

1.2.4 Western blot檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞中JNK及p-JNK 表達(dá)水平：SH-SY5Y細(xì)胞以含 0、4、8、10 μmol/L SSd的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，吹打收集細(xì)胞，預(yù)冷的裂解液每組100 μL冰上裂解10 min，BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白含量后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，各組樣品上樣量均為50 μg蛋白，4℃低溫條件下電轉(zhuǎn)。將NC膜以50 g/L脫脂奶粉封閉液室溫封閉2 h。將JNK及p-JNK一抗分別用封閉液按1∶1 000稀釋后加于NC膜上，4℃過夜。后用封閉液洗膜3次×5 min，將二抗用封閉液按比例稀釋后滴加于NC膜上，37℃作用1 h，TBS洗膜3次×5 min。待NC膜稍干后，在膜上滴加1 mL化學(xué)熒光液，反應(yīng)約1 min后用保鮮膜覆蓋，在暗盒中用X線膠片壓片成像，后顯影、定影。圖像經(jīng)GeneGenius凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 SSd對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)基中NO含量的影響

如圖1所示，與對(duì)照組相比，當(dāng)SSd濃度為4 μmol/L、8 μmol/L 及 10 μmol/L 時(shí)，SH-SY5Y 細(xì)胞培養(yǎng)基中NO含量均明顯減少，其中4 μmol/L SSd組培養(yǎng)基中NO含量最低。上述結(jié)果表明，一定濃度的SSd可抑制該腫瘤細(xì)胞中NO的生成及釋放。

圖1 SSd對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)基中NO含量的影響Fig.1 The effects of SSd on the levels of NO in cell culture ofSH-SY5Y cells

2.2 Western blot結(jié)果

SH-SY5Y 細(xì)胞給予 0、4、8、10 μmol/L SSd 作用48 h 后，與對(duì)照組相比，4 μmol/L SSd 組、8 μmol/L SSd組及10 μmol/L SSd組JNK蛋白磷酸化水平明顯升高，且隨著SSd濃度的增加，SH-SY5Y細(xì)胞p-JNK表達(dá)量逐漸增加（圖2）。

圖2 SSd對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞JNK磷酸化水平的影響Fig.2 The effects of SSd on JNK phosphorylation in SH-SY5Ycells

3 討論

NO為一種無色無味的氣體，早在十六世紀(jì)初期，比利時(shí)科學(xué)家Helmont首次制備出該氣體分子。1980年美國(guó)藥理學(xué)家Furchgott等發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞可產(chǎn)生并釋放一種具有舒血管作用的生物活性物質(zhì)——內(nèi)皮源性舒張因子，1986年多個(gè)實(shí)驗(yàn)小組經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)內(nèi)皮源性舒張因子就是NO。作為1992年美國(guó)《科學(xué)》雜志評(píng)選的該年度“明星分子”，NO的研究自二十世紀(jì)九十年代以來發(fā)展迅速，一躍成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和前沿之一［4］。隨著研究的深入，其在生物體內(nèi)各種生理及病理過程中所起的重要作用被不斷發(fā)現(xiàn)。目前認(rèn)為，NO是一種重要的氣體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子和效應(yīng)分子，廣泛存在于生物體內(nèi)的各種組織、器官，具有影響細(xì)胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)、參與心血管疾病發(fā)生及發(fā)展、預(yù)防肺部疾病發(fā)生等多種功效［5～9］。研究發(fā)現(xiàn)，NO在不同的生理及病理?xiàng)l件下對(duì)不同的細(xì)胞可以表現(xiàn)出促進(jìn)或抑制細(xì)胞增殖的雙重作用，這也體現(xiàn)了NO生物活性的多樣性和復(fù)雜性。本課題組率先研究了SSd對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的作用及相應(yīng)分子機(jī)制。我們前期觀察了不同濃度的SSd對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的影響，并證實(shí)一定濃度的SSd可明顯抑制SH-SY5Y細(xì)胞的生長(zhǎng)及增殖，且呈濃度效應(yīng)關(guān)系。在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步研究了SSd是否對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞NO的生成量有所影響。研究結(jié)果顯示，在一定范圍內(nèi)，隨著SSd濃度的增加，SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)基中NO的濃度與對(duì)照組相比明顯降低，證實(shí)SSd可減少該腫瘤細(xì)胞系產(chǎn)生及釋放NO分子，提示SSd可能通過抑制NO信號(hào)分子的產(chǎn)生而影響細(xì)胞生長(zhǎng)增殖。同時(shí)，我們觀察到4 μmol/L SSd組NO濃度下降最為明顯，這可能是由于該濃度的SSd對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞一氧化氮合酶活性的影響較大，因此對(duì)NO的生成抑制作用較強(qiáng)。

JNK又被稱為應(yīng)激活化蛋白激酶，為絲裂原激活的蛋白激酶家族的主要成員之一。研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)外的各種信號(hào)分子，如電離輻射、滲透壓、熱休克、氧化損傷、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等均可激活JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。目前認(rèn)為，JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡以及多種疾病的發(fā)生及發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用。JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常改變可引起腫瘤、神經(jīng)退行性改變、缺血再灌注損傷、慢性炎癥、糖尿病等多種病理變化［10～14］。大量研究結(jié)果證實(shí)，JNK活化后可促進(jìn)多種細(xì)胞發(fā)生凋亡。有研究顯示，JNK的激活在NO誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起一定的作用，具體機(jī)制可能與caspase-3的活性增強(qiáng)有關(guān)［15］。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，一定濃度的SSd可引起SH-SY5Y細(xì)胞中p-JNK表達(dá)量明顯增加，且隨著SSd濃度的增加，JNK磷酸化水平呈逐漸上升趨勢(shì)，提示在SSd引起的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖抑制過程中有JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的激活。由此可見，NO及JNK在不同誘導(dǎo)因素的作用下發(fā)生的改變也有所不同。接下來，我們將進(jìn)一步深入研究SSd引起的NO生成量的變化及JNK蛋白磷酸化水平改變的分子機(jī)制以及二者之間是否存在相關(guān)性。

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