脈沖射頻及連續(xù)射頻對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)的影響觀察

師存?zhèn)ィ磿赠i，劉詠梅，冶占福，宋濤

（1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院疼痛科，西寧 810001；2.沈陽(yáng)市一五七醫(yī)院內(nèi)科，沈陽(yáng) 110045；3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院疼痛科，沈陽(yáng) 110001）

目前，射頻治療廣泛應(yīng)用于疼痛治療領(lǐng)域。治 療的疾病主要包括三叉神經(jīng)痛、枕大神經(jīng)痛、帶狀皰疹后神經(jīng)痛、脊神經(jīng)根性痛以及癌痛等，并取得了明確的臨床效果［1～4］。在疼痛治療中常用的射頻模式包括：脈沖射頻、連續(xù)射頻、雙極射頻等，其中連續(xù)射頻技術(shù)（continuous radiofrequency，CRF）與其他破壞感覺(jué)神經(jīng)傳導(dǎo)通路的方法相似。通過(guò)使射頻針尖周?chē)陌薪M織凝固壞死而終止神經(jīng)信號(hào)的傳導(dǎo)［5］，在止痛的同時(shí)通常會(huì)造成相關(guān)區(qū)域的皮膚感覺(jué)減退，而出現(xiàn)麻木或蟻?zhàn)吒?。而脈沖射頻（pulsed radiofrequency，PRF）在臨床治療中同樣具有止痛的效果，且不伴有皮膚感覺(jué)的減退，但其起效時(shí)間較連續(xù)射頻慢，同時(shí)療效維持時(shí)間也有待于深入觀察［6，7］。本研究比較CRF及PRF對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)上的影響，探究PRF的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

50只雄性Wistar大鼠（青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供），清潔級(jí)，體質(zhì)量180～220 g。

所有研究動(dòng)物水、食物供應(yīng)充足，生長(zhǎng)室溫20～26℃，相對(duì)濕度55%±15%，無(wú)噪音、強(qiáng)光，晝夜節(jié)律正常的環(huán)境中。50只大鼠隨機(jī)分5組，每組10只。

1.2 處理方法

所有大鼠均給予氯胺酮（80 mg/kg）聯(lián)合甲苯噻嗪（25 mg/kg）腹腔注射麻醉后，沿右臀部做一斜切口，剝離肌肉，暴露右側(cè)坐骨神經(jīng)（暴露范圍從坐骨切跡至脛、腓神經(jīng)分叉處）。需接受射頻處理的大鼠射頻針于脛、腓神經(jīng)分叉前插入坐骨神經(jīng)，選用美國(guó)施樂(lè)輝公司生產(chǎn)的PMG-230型射頻儀進(jìn)行射頻處理。然后依次按如下方式處理大鼠：對(duì)照組，僅暴露神經(jīng)不做任何其他處理；假實(shí)驗(yàn)組，脈沖電極針插入坐骨神經(jīng)120 s，但電極不通電。PRF-42℃組，按照2 Hz的脈沖射頻頻率，每次持續(xù)20 ms，處理時(shí)間120 s，溫度設(shè)定為42℃；CRF-42℃組，使用連續(xù)射頻的方式對(duì)坐骨神經(jīng)進(jìn)行熱凝，處理時(shí)間120 s，溫度設(shè)定為42℃；CRF-70℃組，同樣使用連續(xù)射頻的方式對(duì)坐骨神經(jīng)進(jìn)行熱凝，處理時(shí)間120 s，溫度設(shè)定為70℃。處理結(jié)束后，皮膚切口縫合。21 d后處死大鼠，取坐骨神經(jīng)組織做電子顯微鏡檢查。

1.3 電子顯微鏡檢查

組織標(biāo)本用2.5%戊二醛固定6 h后，用磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）洗滌。再次于1%的四氧化鋨及戊二醛緩沖液（pH 7.4）中固定2 h，梯度乙醇脫水后，使用環(huán)氧丙烷洗滌，再以環(huán)氧樹(shù)脂包埋。用LKB-Nova V型超薄切片機(jī)（瑞典）做2 μm半薄切片，將半薄切片用亞甲藍(lán)染色，然后用尼康Eclipse600（日本尼康公司）光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。對(duì)半薄切片進(jìn)行修整和定位后做60 nm的超薄切片，并用醋酸鈾和檸檬酸鉛染色5 min，然后用JEM 1200EX透射電鏡和Orius SC 1000型數(shù)字化相機(jī)（日本Jeol有限公司）進(jìn)行電子顯微鏡觀察和照相。

1.4 數(shù)據(jù)分析

從每個(gè)樣本中隨機(jī)選取2張切片，每組10個(gè)樣本共20張切片，從每張切片內(nèi)選出10個(gè)髓鞘軸突進(jìn)行觀察分析并分級(jí)。病理分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)［8］：0級(jí)：正常結(jié)構(gòu)；1級(jí)：髓鞘結(jié)構(gòu)分層；2級(jí)：髓鞘結(jié)構(gòu)斷裂；3級(jí)：出現(xiàn)蜂巢樣結(jié)構(gòu)；4級(jí)：髓鞘崩解形成髓鞘球。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，行χ2檢驗(yàn)，P＆lt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠電鏡觀察結(jié)果

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)大鼠傷口感染、自殘、死亡事件發(fā)生。各組大鼠無(wú)髓鞘軸突超微結(jié)果未見(jiàn)明顯異常。對(duì)照組大鼠大部分的髓鞘軸突顯示正常（圖1）。假實(shí)驗(yàn)組中大鼠大部分髓鞘軸突顯示正常，但小部分表現(xiàn)為磷脂脫落（圖2），這可能與研究過(guò)程中缺乏灌注有關(guān)。PRF-42℃組大鼠未發(fā)現(xiàn)存在嚴(yán)重變性的髓鞘軸突。大部分軸突僅表現(xiàn)為磷脂脫落，并且可同時(shí)觀察到新形成的髓鞘軸突（圖3）。CRF-42℃組大鼠約1/3的髓鞘軸突可以觀察到嚴(yán)重的變性（Wallerian變性）。這些變性的軸突可見(jiàn)髓鞘崩脫、形成髓鞘球，細(xì)胞骨架成絮狀或消失，線粒體膨脹或消失。損壞的軸突只存在電極作用部位，而遠(yuǎn)離該處的組織中髓鞘軸突形態(tài)正常。該組同樣觀察到新形成的髓鞘軸突（圖4）。CRF-70℃組大鼠大部分髓鞘軸突可以觀察到嚴(yán)重的變性（Wallerian變性），同時(shí)可見(jiàn)髓鞘崩脫、形成髓鞘球，細(xì)胞骨架成絮狀或消失，線粒體膨脹或消失。該組大鼠所有的髓鞘軸突均遭到不同程度破壞，電鏡下所有的軸突均表現(xiàn)出病理改變（圖5）。

圖1 對(duì)照組電鏡下超微結(jié)構(gòu)觀察×6000Fig.1 Observation of ultrastructure under electron microscope inthe control group×6 000

圖2 假實(shí)驗(yàn)組電鏡下超微結(jié)構(gòu)觀察（白色箭頭指示脫落的磷脂，黑色箭頭指示無(wú)髓鞘軸突）×6000Fig.2 Observation of ultrastructure under electron microscope inthe sham group （white arrow：loss of the phospholipids，black arrow：unmyelinated axon）×6 000

圖3 PRF-42℃組電鏡下超微結(jié)構(gòu)觀察（白色箭頭指示脫落的磷脂，黑色箭頭指示無(wú)髓鞘軸突）×6000Fig.3 Observation of ultrastructure under electron microscope inthe PRF-42 ℃ group （white arrow：loss of the phospholipids，black arrow：unmyelinated axon）×6000

圖4 CRF-42℃組電鏡下超微結(jié)構(gòu)觀察（白色箭頭指示髓鞘球，黑色箭頭指示腫脹的線粒體）×6000Fig.4 Observation of ultrastructure under electron microscope inthe CRF-42 ℃ group（white arrow：ovoid myelin，black arrow：swollen mitochondria）×6000

2.2 各組分級(jí)情況比較

圖5 CRF-70℃組電鏡下超微結(jié)構(gòu)觀察（白色箭頭指示髓鞘球，黑色箭頭指示腫脹的線粒體）×6000Fig.5 Observation of ultrastructure under electron microscope inthe CRF-70 ℃ group （white arrow：ovoid myelin，black arrow：swollen mitochondria）×6000

對(duì)照組及假實(shí)驗(yàn)組未觀察到2～4級(jí)變性，PRF-42℃組展示較好的分級(jí)情況，而CRF-70℃組分級(jí)情況最差。所有實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較分級(jí)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＆lt;0.05）。而且PRF-42℃組、CRF-42℃組、CRF-70℃組3組間兩兩比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＆lt;0.05），見(jiàn)表1。

3 討論

CRF探針溫度一般設(shè)定為60～80℃，這可造成靶組織的凝固性壞死。因此，CRF可以有效破壞選擇區(qū)域的神經(jīng)，造成持續(xù)的真皮區(qū)域的感覺(jué)遲鈍而產(chǎn)生長(zhǎng)久的止痛效果。PRF被認(rèn)為是一種溫和而安全的射頻技術(shù)，與CRF比較PRF對(duì)周?chē)M織及神經(jīng)的損傷較輕［9］。而 Van Zundert等［10］的研究發(fā)現(xiàn)，慢性盆腔疼痛、慢性三叉神經(jīng)疼痛患者行PRF治療后未發(fā)現(xiàn)明確不良反應(yīng)。何云武等［11］分析了24例腰椎間盤(pán)突出患者行PRF的治療效果，發(fā)現(xiàn)PRF治療與常規(guī)治療比較可以顯著降低患者術(shù)后1周、1個(gè)月及3個(gè)月的疼痛評(píng)分，制痛效果明顯。

以往認(rèn)為射頻電流只對(duì)小的無(wú)髓神經(jīng)纖維有影響。而Kanpolat等［12］認(rèn)為CRF的止痛作用是通過(guò)破壞有髓神經(jīng)及無(wú)髓神經(jīng)纖維實(shí)現(xiàn)的。本研究發(fā)現(xiàn)CRF及PRF均不會(huì)造成無(wú)髓神經(jīng)纖維的損害，而CRF-42℃可造成約1/3的髓鞘軸突可以觀察到嚴(yán)重的變性，造成軸突的髓鞘崩脫、形成髓鞘球，細(xì)胞骨架成絮狀或消失，線粒體膨脹或消失。隨著CRF溫度升高，70℃時(shí)大部分髓鞘軸突可以觀察到嚴(yán)重變性，并且神經(jīng)及其周?chē)M織均有不同程度損害。說(shuō)明CRF的止痛作用與有髓神經(jīng)纖維的損害有關(guān)。然而脈沖射頻治療疼痛的機(jī)制至今尚未完全闡明。國(guó)外學(xué)者［7］認(rèn)為PRF止痛的機(jī)制可能與其在神經(jīng)組織間形成的電動(dòng)勢(shì)有關(guān)，這可以造成諸如質(zhì)膜破壞、影響細(xì)胞主要功能的分子鏈破壞等細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變。本研中PRF-42℃與CRF-42℃神經(jīng)病變的分級(jí)存在明顯差異，前者顯著低于后者，并且超微結(jié)構(gòu)的改變更加輕微。再次說(shuō)明PRF的止痛作用與熱效應(yīng)關(guān)系不大。而本研究中PRF組僅觀察到有髓神經(jīng)纖維磷脂的脫落，推測(cè)其鎮(zhèn)痛作用可能與此有關(guān)。因?yàn)樗枨实拿撀淇稍斐缮窠?jīng)傳導(dǎo)阻斷，進(jìn)而發(fā)揮止痛作用。而磷脂層的脫落可能與電磁場(chǎng)對(duì)細(xì)胞膜的作用有關(guān)。

表1 各組超微結(jié)構(gòu)分級(jí)情況Tab.1 Grading scores of ultrastructure in different groups

綜上所述，脈沖射頻時(shí)的高頻電磁場(chǎng)可能導(dǎo)致可逆性的磷脂脫落；而有髓神經(jīng)纖維磷脂脫落則可能阻斷神經(jīng)沖動(dòng)的傳導(dǎo)，發(fā)揮鎮(zhèn)痛效果。PRF的止痛機(jī)制可能與熱作用無(wú)關(guān)。本研究觀察了不同射頻參數(shù)對(duì)正常神經(jīng)纖維超微結(jié)構(gòu)的影響，并結(jié)合臨床現(xiàn)象進(jìn)行初步的分析，為后續(xù)的研究奠定了基礎(chǔ)。今后可以通過(guò)建立不同機(jī)制的疼痛模型，研究射頻對(duì)病理狀態(tài)下的神經(jīng)纖維超微結(jié)構(gòu)的影響及相關(guān)的動(dòng)物行為學(xué)變化。另外在臨床上，以“神經(jīng)節(jié)”和“神經(jīng)纖維”不同部位為靶點(diǎn)進(jìn)行的射頻治療具有不同的臨床效果，今后可以對(duì)“神經(jīng)節(jié)”及“神經(jīng)纖維”等不同部位的射頻治療進(jìn)行比較，深入探討射頻在疼痛治療中的機(jī)制。

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