長期遞增負(fù)荷運(yùn)動對大鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性、凋亡及凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

王雪芹，郝選明

運(yùn)動免疫學(xué)研究業(yè)已證實(shí)，長期從事長時間大強(qiáng)度運(yùn)動對免疫機(jī)能有非常強(qiáng)烈的負(fù)性影響［2］，表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，亞群改變；細(xì)胞毒性降低，細(xì)胞免疫功能受損；主要免疫球蛋白及補(bǔ)體含量降低；中性粒細(xì)胞吞噬作用降低；大負(fù)荷運(yùn)動降低巨噬細(xì)胞的抗原提呈及MHC的表達(dá)等，說明長期大強(qiáng)度運(yùn)動訓(xùn)練對細(xì)胞和體液免疫都有明顯的負(fù)性作用。為了進(jìn)一步揭示長期大強(qiáng)度運(yùn)動對免疫機(jī)能及機(jī)制的影響，課題組前期進(jìn)行了大量研究，發(fā)現(xiàn)6周遞增負(fù)荷運(yùn)動會使中樞免疫器官骨髓、胸腺中B細(xì)胞和T細(xì)胞的發(fā)育分化失衡；會影響外周免疫器官脾臟、小腸集合淋巴結(jié)中淋巴細(xì)胞的增殖分化、吞噬能力、IL－2表達(dá)、sIL－2R 表 達(dá) 及 凋 亡 等［3，9－11，13］。

脾臟是重要的外周免疫器官，是淋巴細(xì)胞定居、增殖和產(chǎn)生免疫應(yīng)答的場所。那么，6周遞增負(fù)荷運(yùn)動會導(dǎo)致脾臟淋巴細(xì)胞增殖活性和凋亡的改變，從而影響機(jī)體的免疫水平嗎？其機(jī)制又是什么？本研究主要通過觀察遞增負(fù)荷運(yùn)動對脾臟淋巴細(xì)胞的增殖能力、線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，△Ψm）的變化及Bax和Bcl－2 mRNA的表達(dá)情況，探討6周遞增負(fù)荷運(yùn)動對脾臟淋巴細(xì)胞增殖活性與凋亡及機(jī)制。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象與分組

8周齡、64只SPF級雄性SD大鼠［購自廣東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號：SCXK（粵）2008－0020；NO：0104976，粵監(jiān)證字F2008A002］被隨機(jī)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組［0周組（WK0）、2周組（WK2）、4周組（WK4）和6周組（WK6）］共8組，每組8只。實(shí)驗(yàn)組32只進(jìn)行6周遞增強(qiáng)度訓(xùn)練；對照組32只正常喂養(yǎng)，不進(jìn)行運(yùn)動干預(yù)，用于判別大鼠生長對測試指標(biāo)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組指標(biāo)各周之間沒有顯著性差異（P＞0.05），表明6周生長對這些指標(biāo)沒有顯著影響。實(shí)驗(yàn)組分別于第0、2、4、6周周末取脾臟并測試相關(guān)指標(biāo)。

1.2 運(yùn)動方案

本研究采用6周遞增負(fù)荷運(yùn)動模型（表1），本模型是課題組通過反復(fù)實(shí)驗(yàn)性探索獲得的運(yùn)動性免疫失衡發(fā)生、發(fā) 展 的 動 物 訓(xùn) 練 模 型［3，9，11－13］。 采 用 適 應(yīng) 性 運(yùn) 動 訓(xùn) 練 （10 m／min）1周后，負(fù)荷遞增至20m／min；隨后，每周負(fù)荷增量5m／min；第6周時達(dá)到40m／min，基本達(dá)到大鼠的最大負(fù)荷強(qiáng)度。分別于第0、2、4、6周的最后一次運(yùn)動后48 h，安靜狀態(tài)下無菌取脾臟。

無菌取得大鼠脾臟后，一部分用錫紙包好放在液氮中，用于mRNA的研究；一部分直接放入滅菌的PBS中，制備細(xì)胞懸液，進(jìn)行淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)和線粒體膜電位的測定。

表1 本研究運(yùn)動訓(xùn)練方案一覽表Table 1 List of Exercise Plan in the Study

1.3 測試指標(biāo)與方法

1.3.1 脾臟系數(shù)的測定

在冰塊上迅速分離取脾臟，稱重，用于計(jì)算脾臟系數(shù)［脾臟系數(shù)＝脾臟重量（mg）／體重（g）×100%］。

1.3.2 淋巴細(xì)胞懸液的制備［7］及 MTT法測定淋巴細(xì)胞刺 激 指 數(shù)［5，15，21］

無菌摘取脾臟，用200目鋼網(wǎng)把脾臟研磨到PBS中，制備成細(xì)胞液；吸取淋巴細(xì)胞分層液（每8ml細(xì)胞液加3 ml分層液）置于10ml離心管中，然后將離心管傾斜45°角，將細(xì)胞液在距分層液界面1cm處沿試管壁緩慢加至分層液上面，注意保持兩者界面清晰，勿使血液混入分層液內(nèi)；將離心管放于水平式離心機(jī)內(nèi)，在18℃～20℃下，以2 000rpm離心20min。離心后，用毛細(xì)吸管吸取淋巴細(xì)胞懸液；將所得細(xì)胞懸液用PBS洗滌2次，依次以2 000 rpm、1 500rpm，離心10min；用完全 RPMI－1640定容細(xì)胞，記數(shù)細(xì)胞后再調(diào)整細(xì)胞至所需濃度。細(xì)胞活力和數(shù)目測定采用計(jì)數(shù)板法：將細(xì)胞懸液0.5ml加入試管中，后加入0.5ml 0.1%的臺盼藍(lán)染液，染色1min；鏡下觀察，不著色、體積較小、折光性強(qiáng)者為活淋巴細(xì)胞，凡染成藍(lán)色、體積較大且無光澤者為死淋巴細(xì)胞。鏡下取幾個任意視野分別計(jì)數(shù)死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)?；盍y定可以與細(xì)胞計(jì)數(shù)同時進(jìn)行，但要考慮到染液對原細(xì)胞懸液的加倍稀釋作用?；罴?xì)胞數(shù)／ml＝（4個大方格內(nèi)活細(xì)胞總數(shù)／4）×2×104；活細(xì)胞數(shù)%＝活細(xì)胞數(shù)／（活細(xì)胞數(shù)＋死細(xì)胞數(shù)）×100%.

用加樣器將制備好的淋巴細(xì)胞懸液（濃度2×106／ml）加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（100μl／孔），每個樣本加6孔，6個樣本孔中，其中3孔加ConA，100μl／孔，另外3孔加培養(yǎng)液作對照，100μl／孔；置5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68h，后每孔加入10μl質(zhì)量濃度為5mg／ml的 MTT，37℃溫育4h（共72h）；每孔加入溶劑100μl，稍振蕩待甲肷產(chǎn)物充分溶解；用酶標(biāo)儀（Tecan Infinite F200）以波長570nm測定OD值，重復(fù)3次；計(jì)算SI（Stimulating Index）＝ConA刺激管中的OD均值／對照管中的OD均值。

1.3.3 線粒體膜電位測定

1.3.4 Bax、Bcl－2mRNA的測定

RNAiso Plus和SYBR○RPremix Ex TaqTM 反應(yīng)試劑購自（TaKaRa）大連寶生物公司；引物（表2）委托上海Invitrogen公司合成；采用全自動熒光定量PCR儀進(jìn)行測定。反應(yīng)結(jié)束后，PCR儀給出各反應(yīng)孔的Ct值，以甘油醛－3－磷酸脫氫酶（GAPDH）基因?yàn)閮?nèi)參，根據(jù)公式2－△△Ct計(jì)算樣品目的基因的相對表達(dá)量。

表2 本研究GAPDH、Bax、Bcl－2的引物情況一覽表Table 2 Gene－specific Primers of GAPDH，Bax，Bcl－2

1.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 長期遞增負(fù)荷運(yùn)動對大鼠脾系數(shù)及淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)（SI）的影響

結(jié)果顯示，6周遞增負(fù)荷運(yùn)動過程中，大鼠脾臟系數(shù)是呈遞減的。與WK0組相比，WK2組的脾臟系數(shù)明顯低于WK0組，差異顯著（P＜0.05）；WK4、WK6組的脾臟系數(shù)也都明顯低于 WK0組，差異非常顯著（P＜0.01）。在6周遞增負(fù)荷運(yùn)動過程中，大鼠脾臟淋巴細(xì)胞SI也明顯降低。與WK0組相比，WK4、WK6組的脾臟淋巴細(xì)胞SI都明顯低于 WK0組，差異顯著（P＜0.05）。與 WK2組相比，WK4、WK6組的脾臟淋巴細(xì)胞SI都明顯低于 WK2組，差異顯著（P＜0.05；表3）。

2.2 長期遞增負(fù)荷運(yùn)動對大鼠脾臟淋巴細(xì)胞△Ψm的影響

表3 本研究大鼠脾臟淋巴細(xì)胞SI的變化一覽表Table 3 Changes of Lymphocyte SI in Spleen

表4 本研究大鼠脾臟淋巴細(xì)胞△Ψm的變化一覽表Table 4 Changes of Lymphocyte△Ψm in Spleen

圖1 本研究各組代表性JC－1檢測結(jié)果示意圖Figure 1. The Representative Results of JC－1in Groups

2.3 長期遞增負(fù)荷運(yùn)動對大鼠脾臟淋巴細(xì)胞Bax mRNA表達(dá)的影響

6周遞增負(fù)荷運(yùn)動過程中，Bax mRNA表達(dá)水平整體是升高的。與WK0組相比，WK2組的Bax mRNA表達(dá)升高，但沒有顯著性差異；WK4和 WK6組的Bax mRNA表達(dá)明顯升高，且差異非常顯著（P＜0.01）。與 WK2相比，WK4、WK6組的Bax mRNA表達(dá)明顯升高，差異非常顯著（P＜0.01）。與 WK4組相比，WK6組的Bax mRNA表達(dá)略有升高，但沒有顯著性差異（表5）。

2.4 長期遞增負(fù)荷運(yùn)動對大鼠脾臟淋巴細(xì)胞Bcl－2mRNA表達(dá)的影響

6周遞增負(fù)荷運(yùn)動過程中，Bcl－2mRNA的表達(dá)整體是降低的。與 WK0組相比，WK2組的Bcl－2mRNA表達(dá)下降，差異顯著（P＜0.05）；WK4和 WK6組的 Bcl－2mRNA表達(dá)也明顯下降，差異非常顯著（P＜0.01）。與 WK2組相比，WK4、WK6組的Bcl－2mRNA表達(dá)明顯降低，差異非常顯著（P＜0.01）。與 WK4組相比，WK6組的Bcl－2mRNA表達(dá)略有下降，但沒有顯著性差異（表5）。

2.5 長期遞增負(fù)荷運(yùn)動對脾臟淋巴細(xì)胞Bcl－2／Bax的影響

6周遞增負(fù)荷運(yùn)動過程中，Bcl－2／Bax比值整體表現(xiàn)為明顯降低。與 WK0組相比，WK2組的Bcl－2／Bax比值明顯下降，差異顯著（P＜0.05）；WK4和 WK6組的 Bcl－2／Bax比值也明顯下降，差異非常顯著（P＜0.01）。與 WK2組相比，WK4、WK6組的Bcl－2／Bax明顯減小，差異非常顯著（P＜0.05）；與 WK4組相比，WK6組的 Bcl－2／Bax有所下降，但沒有顯著性差異（表5）。

表5 本研究大鼠脾臟淋巴細(xì)胞SI的變化以及Bax和Bcl－2mRNA的變化一覽表Table 5 Changes of Lymphocyte Bax mRNA and Bcl－2mRNA in Spleen

3 討論

脾臟是體內(nèi)主要的免疫器官，其重量及器官指數(shù)反映了免疫器官的發(fā)育情況，能間接的反映機(jī)體的免疫水平。本研究結(jié)果顯示，6周遞增負(fù)荷運(yùn)動可使大鼠的脾臟系數(shù)降低，且隨著運(yùn)動時間的延長和強(qiáng)度的增加，脾臟系數(shù)下降明顯。與筆者前期的研究一致［11］。另外，課題組前期的脾臟HE染色結(jié)果顯示，脾臟的內(nèi)部結(jié)構(gòu)隨著運(yùn)動時間的延長、負(fù)荷的不斷增加，出現(xiàn)了紅髓、白髓、邊緣區(qū)內(nèi)淋巴細(xì)胞的不斷減少，從第2周開始，脾小體內(nèi)出現(xiàn)了生發(fā)中心，紅髓、白髓、邊緣區(qū)之間的界限也開始模糊不清［5］。提示，6周遞增負(fù)荷運(yùn)動不僅影響了脾臟的正常質(zhì)量，也在很大程度上損傷了脾臟的結(jié)構(gòu)，可能導(dǎo)致了脾臟的萎縮。

通過分析6周遞增負(fù)荷運(yùn)動對脾臟系數(shù)及脾臟結(jié)構(gòu)的影響，不難發(fā)現(xiàn)，免疫器官脾臟對6周遞增負(fù)荷運(yùn)動的反應(yīng)是明顯的，為了進(jìn)一步了解機(jī)體的免疫機(jī)能狀態(tài)，本實(shí)驗(yàn)測定了脾臟淋巴細(xì)胞增殖活性，淋巴細(xì)胞增殖活性的測試是評價體內(nèi)淋巴細(xì)胞功能狀態(tài)的一個重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，6周遞增負(fù)荷運(yùn)動使 WK4、WK6組大鼠的脾淋巴細(xì)胞的增殖活性明顯低于WK0、WK2組。說明6周遞增負(fù)荷運(yùn)動降低了脾淋巴細(xì)胞的增殖活性，使淋巴細(xì)胞功能下降，影響了機(jī)體的免疫水平。矯瑋等［4］報(bào)道，力竭運(yùn)動后T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化明顯降低。Green等［18，19］研究也發(fā)現(xiàn)，劇烈運(yùn)動會降低體外T淋巴細(xì)胞的增殖應(yīng)答能力。

另外，淋巴細(xì)胞凋亡增加也會影響機(jī)體的正常免疫功能。大量資料顯示，力竭運(yùn)動后外周血和免疫器官淋巴細(xì)胞 凋 亡 增 加 ，并 往 往 會 伴 隨 免 疫 機(jī) 能 下 降［6－7，14，22］。 于 是 ，本實(shí)驗(yàn)對各組大鼠脾臟淋巴細(xì)胞的△Ψm進(jìn)行了測定，因?yàn)榫€粒體既是細(xì)胞的動力工廠，又是細(xì)胞凋亡信號的提供者?！鳓穖是多種細(xì)胞凋亡過程中最重要的事件之一［16，20］。本研 究 發(fā) 現(xiàn)，在 遞 增 負(fù) 荷 運(yùn) 動 過 程 中，WK2、WK4、WK6組大鼠的△Ψm明顯低于0周組。提示，6周遞增負(fù)荷運(yùn)動降低了大鼠脾臟淋巴細(xì)胞的△Ψm，使脾臟淋巴細(xì)胞凋亡增加。說明6周遞增負(fù)荷運(yùn)動對脾臟淋巴細(xì)胞的增殖活性產(chǎn)生影響的同時也影響淋巴細(xì)胞凋亡，且隨著運(yùn)動時間和強(qiáng)度的增加，影響更加顯著。

凋亡又稱程序性死亡，發(fā)生的原因和途徑是復(fù)雜多樣的，許多基因參與細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控。其中，Bcl－2家族是目前最受關(guān)注的調(diào)控細(xì)胞凋亡的基因家族，目前家族中人們共發(fā)現(xiàn)30個成員，包括抑制凋亡蛋白 Bcl－2、Bcl－x、Bcl－XL等 ，促 進(jìn) 凋 亡 蛋 白 包 括 Bax、Bcl－10、Bid 等［17，24，26］。Bax接到凋亡信息后，會插入線粒體膜中，促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素C，激活下游因子，裂解底物，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［23］。另外，Bax和Bcl－2的作用是相互拮抗的，當(dāng)Bax同源二聚體形成，會誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；而Bcl－2表達(dá)上升時，Bax二聚體會分開，從而組織抑制凋亡的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，隨著運(yùn)動負(fù)荷的遞增，WK4和WK6組大鼠脾臟淋巴細(xì)胞Bax mRNA表達(dá)明顯增加；而 WK2、WK4和 WK6組大鼠脾臟淋巴細(xì)胞Bcl－2mRNA表達(dá)明顯降低；WK2、WK4和WK6組大鼠周脾臟淋巴細(xì)胞Bcl－2／Bax比值也明顯降低。另外，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，6周遞增負(fù)荷運(yùn)動過程中，大鼠小腸集合淋巴結(jié)Bax蛋白表達(dá)增加，而Bcl－2蛋白表達(dá)下降，Bcl－2／Bax的比值也下降，得出大鼠小腸集合淋巴結(jié)細(xì)胞凋亡增加［8］，即隨著運(yùn)動時間延長和強(qiáng)度的加大，脾臟淋巴細(xì)胞的Bcl－2／Bax比值明顯減小，△Ψm也明顯降低。說明6周遞增負(fù)荷運(yùn)動可能是通過改變調(diào)控基因Bax mRNA和Bcl－2mRNA的表達(dá)而使細(xì)胞凋亡增加的，而細(xì)胞凋亡增加可能是長時間大強(qiáng)度運(yùn)動導(dǎo)致機(jī)體免疫水平下降的原因之一。

4 結(jié)論

1.大鼠脾系數(shù)變小，脾臟淋巴細(xì)胞增殖活性降低，可能是6周遞增負(fù)荷運(yùn)動造成機(jī)體免疫水平下降的原因之一。

2.脾臟淋巴細(xì)胞線粒體膜電位明顯下降、細(xì)胞凋亡增加很可能是6周遞增負(fù)荷運(yùn)動造成機(jī)體免疫水平下降的另一原因。其機(jī)制可能是通過改變調(diào)控基因Bax mRNA和Bcl－2mRNA表達(dá)，而使脾淋巴細(xì)胞細(xì)胞凋亡增加，影響機(jī)體免疫水平。

3.長期遞增負(fù)荷運(yùn)動過程中，大鼠脾淋巴細(xì)胞凋亡的增加可能是造成淋巴細(xì)胞增殖活性降低的因素之一，但具體機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

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