蠟蚧輪枝菌侵染黑刺粉虱體表過(guò)程的顯微觀察

曾 君，田 麟，王金明，王聯(lián)德

(福建農(nóng)林大學(xué)生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州350002)

黑刺粉虱Aleurocanthus spiniferus(Quaintanca)在我國(guó)茶葉、柑桔、荔枝、龍眼等主要產(chǎn)區(qū)危害嚴(yán)重(任順祥等，2011)。近年來(lái)在福建、廣東、浙江、貴州等地嚴(yán)重為害茶樹(shù)，2002年以來(lái)每年發(fā)生面積達(dá)10．6萬(wàn)hm2，每畝茶園平均減產(chǎn)1-2成，嚴(yán)重的減產(chǎn)3-4成，嚴(yán)重影響了茶業(yè)的生產(chǎn);在福建、浙江、湖北、四川、重慶、貴州等地為害柑桔，每年發(fā)生面積達(dá)14．3萬(wàn) hm2，被害株率達(dá)80%以上，嚴(yán)重影響產(chǎn)量和果實(shí)品質(zhì)(任順祥等，2011;胡雅輝等，2010)。近年來(lái)，黑刺粉虱造成的損失非常慘重，在我國(guó)很多地區(qū)仍有暴發(fā)成災(zāi)之勢(shì)(肖伏蓮等，2009;劉曼等，2010)。目前，對(duì)該蟲(chóng)的防治一般都采用化學(xué)農(nóng)藥為主，盡管短期內(nèi)防治效果較好，但連續(xù)使用會(huì)引起害蟲(chóng)產(chǎn)生抗藥性、殺傷其天敵引起再增猖獗和農(nóng)藥殘留、影響產(chǎn)品衛(wèi)生質(zhì)量等問(wèn)題，因而急需尋求與環(huán)境友好相容性的替代防治方法(王常平等，2011)。蠟蚧輪枝菌Lecanicillium lecanii(Zimmermann)Gams＆Zare的寄主范圍廣，能寄生蚧類(lèi)、蚜蟲(chóng)類(lèi)、螨類(lèi)和粉虱(羅小剛，1982;陳吉棣，1985)，是具有良好應(yīng)用前景的蟲(chóng)生真菌之一(Wang et al．，2004)。本研究以V3450菌株為材料，利用掃描電鏡研究了蠟蚧輪枝菌對(duì)黑刺粉虱侵染過(guò)程中在體表萌發(fā)、生長(zhǎng)和穿透體壁行為。以期探討寄主與病原菌間的相互作用方式及關(guān)系。

1 材料與方法

1．1 供試菌株和蟲(chóng)體

供試菌株是從煙粉虱蟲(chóng)尸上分離的蠟蚧輪枝菌V3450菌株，保存于福建農(nóng)林大學(xué)生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。菌株經(jīng)煙粉虱復(fù)壯后，接種到查氏固體培養(yǎng)基，在25℃、12L:12D智能人工氣候箱中培養(yǎng)7 d備用。

供試?yán)ハx(chóng)黑刺粉虱種群采自福建農(nóng)林大學(xué)后山茶場(chǎng)茶樹(shù)，接到溫室內(nèi)盆栽的茶樹(shù)上飼養(yǎng)，連續(xù)飼養(yǎng)多代后備用。

孢子懸浮液的制備:將培養(yǎng)的蠟蚧輪枝菌V3450菌株，平板內(nèi)加20 mL 0．5% 吐溫-80無(wú)菌水，用玻璃刮刀輕輕將表面刮下，經(jīng)兩層滅菌紗布過(guò)濾，制備成孢子懸浮液母液，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)定每毫升母液的分生孢子含量，再用0．5%吐溫-80無(wú)菌水將其配制成為108個(gè)·mL-1供試孢子懸浮液。

1．2 黑刺粉虱接菌及取樣方法

瓷盤(pán)上放置濕潤(rùn)的花泥，將茶梢插在花泥上，茶梢接剛羽化的黑刺粉虱成蟲(chóng)10頭，用玻璃筒(直徑15 cm，高度25 cm，上端罩以紗布)罩住。將配制好的108個(gè)·mL-1分生孢子懸浮液，用手動(dòng)噴霧器對(duì)著玻璃筒內(nèi)茶葉及蟲(chóng)體噴霧，噴至茶芽葉菌液濕潤(rùn)為止。置于25℃、12L:12D智能人工氣候箱中飼養(yǎng)。分別于接菌后12 h、24 h、72 h取樣，保存于70%乙醇中。

1．3 電鏡觀察

從70%乙醇中保存的樣品中挑選侵染的。樣品在超聲波清洗器(頻率為50 kHz)中用蒸餾水清洗5 min清除表面污物后。將清洗干凈的樣品放入2．5%戊二醛溶液中置于4℃冰箱內(nèi)固定過(guò)夜，將固定好的樣品用0．1 mol·L-1磷酸緩沖液(pH 7．3)沖洗3次，每次10 min。然后用濃度為30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%的酒精逐級(jí)脫水，每級(jí)10 min。再用鋨酸后固定2 h。在PVT-3B型臨界點(diǎn)干燥儀上CO2臨界點(diǎn)干燥2 h。將干燥好的樣品用雙面膠將樣品觀察面朝上粘于樣品臺(tái)。用JFC-1200型鍍膜儀真空噴金鍍膜，置于JSM-5310LV型掃描電鏡于15 kV加速電壓下觀察，拍照。

2 結(jié)果與分析

蠟蚧輪枝菌侵染黑刺粉虱成蟲(chóng)12 h、24 h、72 h后，用掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，蠟蚧輪枝菌在寄主體表主要分布在頭部復(fù)眼(圖1:A)、腹部(圖1:B)、中足和后足(圖1:C)、翅(圖1:D)。接種蠟蚧輪枝菌V3450菌株孢子懸浮液12 h后，附著在蟲(chóng)體上的分生孢子萌發(fā)形成芽管，芽管伸長(zhǎng)形成菌絲，沿蟲(chóng)體表面生長(zhǎng)。接種后24 h菌絲侵入蟲(chóng)體，菌絲在沿寄主表面生長(zhǎng)的同時(shí)還側(cè)向長(zhǎng)出芽管吸附在體表上，此時(shí)寄主體表出現(xiàn)大量菌絲。接種后72 h，萌發(fā)孢子在體表形成長(zhǎng)的菌絲，相互纏繞，蟲(chóng)體被厚厚的菌絲層覆蓋(圖1:E)。表明蠟蚧輪枝菌附著到黑刺粉虱體表后能夠在黑刺粉虱體表生長(zhǎng)，一方面從復(fù)眼、腹部氣孔、足基節(jié)和翅基等部位侵入黑刺粉虱體內(nèi)，一方面在黑刺粉虱體表繁殖直到把黑刺粉虱包圍在內(nèi)，最終致使黑刺粉虱死亡。

蠟蚧輪枝菌V3450菌株的大量孢子成功附著于體壁不同區(qū)域，孢子可見(jiàn)萌發(fā)跡象，孢子一端會(huì)出現(xiàn)芽狀體(圖1:F，G)，侵染黑刺粉虱頭部的蠟蚧輪枝菌孢子萌發(fā)后產(chǎn)生雙芽管或三芽管(圖1:H)。在寄主體表不同結(jié)構(gòu)區(qū)，蠟蚧輪枝菌入侵行為存在一定差異，萌發(fā)形成長(zhǎng)短不一的芽管。在平緩結(jié)構(gòu)區(qū)和刺狀結(jié)構(gòu)區(qū)，接菌后12h，芽管末端膨大，孢子萌發(fā)伸出芽管(圖1:F，G，H)，長(zhǎng)度略短于孢子直徑，一些芽管末端膨大形成附著結(jié)構(gòu)——附著胞(圖1:M，N)。在足及體節(jié)刺狀突起區(qū)已出現(xiàn)芽管或各種附著結(jié)構(gòu)向體壁穿透，在穿透點(diǎn)可見(jiàn)圓形小孔，小孔周?chē)姓碃罘置谖锍霈F(xiàn)，為分泌的酶，芽管逐步伸長(zhǎng)，多超過(guò)孢子縱軸長(zhǎng)度，幾經(jīng)彎折向表皮定向生長(zhǎng)(圖1:I)。在侵染過(guò)程中，可看到芽管的菌絲出現(xiàn)分枝，開(kāi)始生長(zhǎng)，如侵染翅面、頭部和復(fù)眼的芽管的菌絲出現(xiàn)分枝。頭部芽管的菌絲分枝后伸向剛毛的基(圖1:J);復(fù)眼的芽管的菌絲分枝伸向小眼間縫隙，從縫隙中進(jìn)入蟲(chóng)體內(nèi)(圖1:K);翅面上的均勻密布的鱗毛狀微刺，利于孢子的附著，孢子萌發(fā)后產(chǎn)生的芽管，分化出的菌絲分枝后，伸向翅的折褶和翅脈，形成附著胞，附著胞與翅的接觸處有分泌物出現(xiàn)，為分泌的酶，有的形成了侵入釘(圖1:J，K)。

附著胞形狀多樣，緊緊固著在結(jié)構(gòu)區(qū)的平緩區(qū)域(如腹部節(jié)間膜)，隨后進(jìn)行寄透體壁。而在嵴狀結(jié)構(gòu)區(qū)(如布滿微毛的翅)和刺狀結(jié)構(gòu)區(qū)(如中足和后足基節(jié))，芽管常以原有直徑延伸較長(zhǎng)距離，并經(jīng)幾次彎折向體壁方向定向生長(zhǎng)后，多數(shù)直接以芽管穿透體壁(圖1:M)，少數(shù)形成L字形附著胞(圖1:I，J，N)后再刺入體壁。

圖1 蠟蚧輪枝菌對(duì)黑刺粉虱侵染過(guò)程Figure 1 Infection process of Lecanicillium lecanii on Aleurocanthus spiniferus

3 討論

掃描電鏡觀察蠟蚧輪枝菌分生孢子侵染黑刺粉虱成蟲(chóng)體壁的過(guò)程，接種12 h后，附著在蟲(chóng)體上的分生孢子萌發(fā)形成芽管，24 h后菌絲侵入蟲(chóng)體，接種72h后蟲(chóng)體被厚厚的菌絲層覆蓋。蠟蚧輪枝菌侵染朝鮮毛球蚧體壁過(guò)程中，蠟蚧輪枝菌侵染朝鮮毛球蚧Didesmocaccus koreanus 72 h后蟲(chóng)體腹面出現(xiàn)裂痕，裂縫部位夾著生大量菌絲，整個(gè)蟲(chóng)體被菌絲層包圍。蠟蚧輪枝菌分生孢子侵染黑刺粉虱的過(guò)程也與此相似(韓珍珍，2010)。本實(shí)驗(yàn)觀察到，分生孢子可以直接以芽管侵入表皮，也可以產(chǎn)生附著胞再侵入，穿刺點(diǎn)處出現(xiàn)的小孔及附著胞的周?chē)l(fā)現(xiàn)分泌物，證實(shí)了蠟蚧輪枝菌在入侵黑刺粉虱過(guò)程中有酶的活動(dòng)存在，酶對(duì)寄主表皮產(chǎn)生了降解作用。類(lèi)似現(xiàn)象在蠟蚧輪枝菌侵染蚜蟲(chóng)Macrosiphoniella sanborni(Askary et al．，1999)和介殼蟲(chóng) Didesmocaccus koreanus(韓珍珍，2010)、Ceropplastes japonicus(Liu et al．，2009)、Coccus hesperidum(Liu et al．，2011)過(guò)程中也報(bào)道過(guò)。

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