兩種日糧對烏金豬脂肪組織脂類分解代謝相關基因表達的影響

黃 英，李永能，楊明華，潘洪彬，趙素梅*，高士爭*

(1.云南農業(yè)大學 云南省動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，云南 昆明650201；2. 云南農業(yè)大學 招生就業(yè)處，云南 昆明 650201)

烏金豬是云南省優(yōu)良的地方豬種之一，具有耐粗飼、適應性強、肉質優(yōu)良、肌內脂肪豐富等優(yōu)良性狀[1]，但烏金豬繁殖力低、生長慢、瘦肉率低。長期以來烏金豬的飼養(yǎng)主要采用傳統(tǒng)的飼養(yǎng)模式進行，對其優(yōu)良的肉品質性狀所需的日糧適宜營養(yǎng)水平缺乏研究，使其優(yōu)良的肉品質性狀未得到充分、科學、合理的利用。本文以烏金豬適宜能量與蛋白水平研究結果為依據，配制WJ日糧，以美國NRC(1998)推薦的主要營養(yǎng)需要量為依據，配制NRC日糧，研究兩種日糧對烏金豬不同生長階段脂肪組織脂類分解代謝相關基因表達的影響，探討不同營養(yǎng)水平日糧對烏金豬脂肪組織脂類分解代謝的分子機制，為進一步研究烏金豬脂肪沉積過程中脂類分解代謝的變化規(guī)律提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及試驗設計

選取體重約23 kg的烏金豬36頭，公母各半，隨機分為2個處理組，每組設3個重復，每個重復6頭。分三個生長階段，分別于30 kg、60 kg和100 kg體重時屠宰取皮下脂肪組織，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗日糧

以烏金豬適宜能量與蛋白水平研究結果為依據，配制WJ日糧見表1，表3；以美國NRC(1998)推薦的主要營養(yǎng)需要量為依據，配制NRC日糧見表1。

由表1,2可看出，WJ是按照烏金豬最優(yōu)肉品質日糧適宜的能量與蛋白水平(15～30 kg、30日糧來說，WJ是一種低能量低蛋白型日糧。

表1 烏金豬營養(yǎng)需要量與美國NRC(1998)推薦的營養(yǎng)需要量表Tatble 1 Nutritional requirement of Wujin pig (88% DM)

表2 日糧組成與營養(yǎng)水平(%，Mcal/kg)Table 2 Diet composition and nutrient levels

注：復合預混料組成：一水硫酸鋅2.8%，一水硫酸錳2.74%，一水硫酸亞鐵4.03%，五水硫酸銅6.00%，碘化鉀0.46%，亞硒酸鈉0.65%，維生素A 0.01%，維生素D30.01%，維生素E 0.44%，維生素K 0.01%，維生素B10.01%，維生素B20.03%，泛酸0.08%，煙酸0.10%，維生素B120.05%，生物素0.15%，葉酸0.01%，膽堿8.0%，沸石粉74.42%。

Note： Premix composition contains: Zn 2.8%, Mn 2.74%, Fe 4.03%, Cu 6.00%, I 0.46%, Se 0.65%，VA 0.01%, VD30.01%, VE 0.44%, VK 0.01%, VB10.01%, VB20.03%, pantothenic acid 0.08%, nicotinic acid 0.10%, VB120.05%, biotin 0.15%, folic acid 0.01%, choline 8.0%, Zeolite pouder 74.42%

1.3 總RNA提取

取皮下脂肪組織100 mg，用異硫氰酸胍-酚-氯仿提取總RNA，用紫外分光光度計(260 nm)測定總RNA濃度與純度，OD260/OD280=1.8～2.0，并經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性后使用。

1.4 實時定量PCR

根據所測定的濃度，各取2 μg總RNA進行反轉錄，反應體積為20 μL，其中含有：12 μmol/L 隨機引物，0.5 mmol/L dNTP，20U RNA 酶抑制劑 (RNase inhibitor)，10 U 反轉錄酶(M-MLV RTase)，4 μL 5×RT Buffer (含250 mmol/L Tris-HCl pH8.3, 50 mmol/L MgCl2,250 mmol/L KCl, 50 mmol/L DTT, 2.5 mmol/L Spermidine)。先加RNA模板，dNTP和隨機引物，70 ℃變性 5 min，立即放冰上冷卻，再加其余試劑， 42 ℃反應 60 min，95 ℃滅活 5 min。反轉錄后的cDNA單鏈可于-20 ℃中保存。

目的基因：激素敏感脂酶(hormone-sensitive lipase, HSL)、脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase, LPL)、肉堿棕櫚酰轉移酶1(carnitine palmitoyltransferase-1, CPT-1)和過氧化物酶體增殖物激活受體γ(preoxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ)與內參基因18 s，所有基因的引物使用Primer Primer 5軟件設計，由上海生物有限公司合成?；虻卿浱柤耙镄蛄幸姳?。

表3 內參基因與目的基因的引物序列、產物長度和登陸號Table 3 Specific primers used for RT-PCR

Real-time PCR反應體系為20 μL：1.5 μL反轉錄產物，10 μL SYBRμ Premix Ex TaqTM，10 mmol/L的基因引物各0.4 μL，加20 μL ddH2O。每樣品做2次重復，同時用ddH2O代替RT產物和熒光試劑作空白對照，以檢驗是否有外源基因和基因組DNA 污染。各基因PCR的優(yōu)化條件見表4。

表4 實時熒光定量PCR條件Table 4 Conditions for real-time PCR

1.5 定量方法

采用Real-time PCR對各基因的表達進行相對定量，選擇18S rRNA為內標基因，根據下列公式計算基因表達量。公式如下：

sample表示最適日糧組樣本的CT值，calibrator表示NRC日糧組的CT值。目標基因和內標基因(18S rRNA)的平均CT值被用于上公式。通過上式計算出每一個樣本目標基因表達通過18S rRNA均一化處理后相對于NRC日糧組30 kg體重(設為1倍量)時的倍數。

1.6 數據分析

采用SAS9.0和Excel2003軟件對試驗數據進行統(tǒng)計分析，所有數據表示為平均值±標準差，并對平均值進行方差分析，作顯著性檢驗(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 HSL基因的相對表達水平

在各個屠宰體重，WJ日糧組HSL基因相對表達量均高于NRC日糧組(P>0.05，見圖1)。

2.2 LPL基因的相對表達水平

在各個屠宰體重，WJ日糧組 LPL基因相對表達量均顯著高于NRC日糧組(P<0.05，見圖2)。

圖1 HSL基因相對表達量Fig. 1 The expression levels of HSL gene

2.3 CPT-1基因的相對表達水平

30 kg和60 kg屠宰體重，WJ日糧組CPT-1基因的相對表達量顯著高于NRC日糧組(P<0.05)，

圖2 LPL基因相對表達量Fig. 2 The expression levels of LPL gene

注：相同屠宰體重字母不同，差異顯著(P<0.05)，下圖同。

Note： For the same slaughtering body weight, different letters indicate significant difference(P<0.05), the same below.

在100 kg屠宰體重，WJ日糧組CPT-1基因的相對表達量低于NRC日糧組(P>0.05，見圖3)。

2.4 PPARγ基因的相對表達水平

在各個屠宰體重，WJ日糧組PPARγ基因的相對表達量均高于NRC日糧組，在30 kg屠宰體重達到顯著水平(P<0.05，見圖4)。

圖3 CPT-1基因相對表達量Fig. 3 The expression levels of CPT-1 gene

圖4 PPARγ基因相對表達量Fig. 4 The expression levels of PPARγ gene

3 討 論

本試驗以烏金豬為研究對象，圍繞營養(yǎng)水平進行系列研究，確定了最適營養(yǎng)水平標準，探討營養(yǎng)對肉品質形成的相關機理。前期研究分別設立不同的能量和蛋白水平的日糧，用不同能量水平和烏金豬的生產性能和胴體組成建立相關性，通過模糊綜合評定，確定15～30 kg、30～60 kg和60～100 kg生長階段烏金豬最優(yōu)肉品質日糧適宜的能量水平，分別為13.01 MJ/kg、13.08 MJ/kg和13.11 MJ/kg[2-3]；用不同蛋白水平和烏金豬肉品質的三個指標(滴水損失、剪切力和肌內脂肪含量)建立相關性，通過模糊綜合評定，確定15～30 kg、30～60 kg和60～100 kg生長階段烏金豬最優(yōu)肉品質日糧適宜的蛋白水平，分別為15.88%、14.13%和11.42%[4-5]。目前很多資料對脂類代謝調節(jié)因子與脂肪組織脂類代謝之間的關系進行了研究[6-7]，然而從最適宜肉品質日糧水平出發(fā)對烏金豬脂肪組織脂類分解代謝相關基因表達的影響尚缺乏深入研究。

脂肪組織中脂肪的分解及脂肪酸的轉運和氧化對脂肪沉積的影響非常重要。激素敏感脂酶(HSL)是一種在脂肪動員中起重要作用的酶類，是脂肪分解的限速酶，能水解甘油三酯成甘油和脂肪酸以滿足動物體的需要，它一直被認為是調節(jié)動物體脂肪分解的關鍵酶。脂蛋白脂酶(LPL)是脂質代謝中的關鍵酶，它的主要功能是水解極低密度脂蛋白和乳糜微粒中的甘油三酯，使之轉變成相對分子質量較小的脂肪酸，以供各種組織貯存和利用。肉堿脂酰轉移酶1(CPT-1)位于線粒體外膜，它使長鏈脂肪酸和肉堿發(fā)生酯化，以此將長鏈脂肪酸轉運進入線粒體，是脂酰輔酶A轉入線粒體進行脂肪酸β-氧化的限速酶。本研究表明，與NRC日糧組結果比較可知，WJ日糧組促進烏金豬肌肉組織中HSL、LPL和CPT-1基因mRNA相對表達量，與脂肪酸分解代謝相關基因表達受到上調，脂肪組織脂肪動員增強，極低密度脂蛋白和乳糜微粒中的甘油三酯水解為脂肪酸增加，并且脂肪酸β-氧化作用增強，這說明脂肪組織中脂解作用增強，脂肪組織產生的脂肪酸增加，進入線粒體進行β-氧化的脂肪酸增加，脂肪組織的脂肪酸分解作用增強。

在調解脂肪儲存與釋放，維持機體能量平衡以及脂肪細胞分化等方面，過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)具有重要作用，它是一類由配體激活的核轉錄因子，屬于細胞核受體超家族的成員。本研究表明，相對于NRC日糧，WJ日糧顯著促進了烏金豬脂肪組織中PPARγ基因mRNA的表達，脂肪氧化基因表達受到上調，說明脂肪氧化加強。

4 結 論

WJ日糧通過上調脂肪分解代謝相關基因的表達促進了脂肪組織脂肪的分解，減少了脂肪沉積。

參考文獻：

[1] 王忠慶，榮耀先. 大河烏豬與大河豬(烏金豬)肉質形狀研究[J]. 云南農業(yè)科技，2004，(S): 41-44.

[2] Zhang X, Zhao S M, Ge C R, et al. Effects of dietary digestible energy levels on meat quality in Wujin pig[J].Chinese Journal of Animal Nutrition，2008，20(4):338-377.

[3] Zhang X, Zhao S M, Ge C R, et al. Effects of dietary energy levels on growth performance and carcass composition of Wujin pigs[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2008, 20(5): 450-489.

[4] Zhao S M, Wang J, Song X L, et al. Impact of dietary protein on lipid metabolism-related gene expression in porcine adipose tissue[J].Nutrition & Metabolism,2010, 7(6):6-18.

[5] 葛長榮，趙素梅，張 曦，等. 不同日糧蛋白質水平對烏金豬肉品質的影響[J]. 畜牧獸醫(yī)學報，2008，39(12):1 692-1 700.

[6] 潘洪彬，趙素梅，黃 英，等. 飼糧能量水平對烏金豬脂肪組織脂類合成代謝相關基因表達的影響[J].動物營養(yǎng)學報，2011,23(5)：781-788.

[7] 潘洪彬，王 靜，黃 英，等. 飼糧能量水平對烏金豬脂肪組織脂類分解代謝相關基因表達的影響[J]. 動物營養(yǎng)學報，2011,23(11)：1 946-1 952.