南陽黑豬與欒川黑豬的種群遺傳關系研究

江 燕，鐘曉琳，王明民，李紅軍，翟 磊，高騰云

(河南農業(yè)大學 牧醫(yī)工程學院，河南 鄭州 450002)

河南省南陽黑豬又稱宛西八眉豬，其體型中等，頭較短，額部有菱形皺紋，最上面兩條皺紋形似八字，故名“八眉”；主產區(qū)位于伏牛山脈南麓丘陵地區(qū)、緩坡地帶和山前平原，為河南省地方優(yōu)良種質資源品種之一。欒川黑豬產于豫西伏牛山欒川縣，頭形稍長，額部有皺紋，嘴長短中等，耳大稍前傾斜，下垂等特點。伏牛山區(qū)是一個典型的生態(tài)交錯帶[1]，這種生態(tài)環(huán)境的差異致使南陽黑豬與欒川黑豬在外部形態(tài)上存在顯著差異；因而，正確認識兩者之間的遺傳關系并加以合理保護利用已成為當務之急。

由于微衛(wèi)星具有高變異性、高突變率、數量大、共顯性遺傳及在基因組中廣泛分布等特點[2]，因而在群體內、間分析遺傳廣為使用。國內外關于豬微衛(wèi)星研究有不少報道[3-11]，但較少涉及對黑豬種群遺傳關系分析，而南陽與欒川黑豬間遺傳關系分子研究未見報道。鑒于此，本研究利用10個微衛(wèi)星標記對南陽和欒川黑豬群體遺傳關系進行分析，為兩種黑豬品種鑒定的系統(tǒng)研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試豬樣本 南陽黑豬46頭，均采自南陽黑豬主產區(qū)。其中30頭采自南召縣普尼爾農業(yè)開發(fā)有限公司，10頭采自內鄉(xiāng)縣南陽黑豬保種場，6頭采自西峽縣詹鐵軍養(yǎng)殖場。欒川黑豬30頭采自洛陽欒川縣亨利養(yǎng)殖場。隨機采樣前腔靜脈采血，每頭約5 mL，肝素鈉抗凝；血樣用冰塊冷藏運回實驗室，-20 ℃冷凍保存。

1.1.2 試劑與儀器 試劑：Go Taq Green Master Mix/ M7122(美國Promega公司)，丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、N',N',N',N'-四甲基乙二胺(TEMED)、Tris(Sigma公司)，PBR322 DNA/MspI(鄭州寶賽)。儀器：9700PCR擴增儀(ABI)，T-PCR儀，Labwork凝膠成像分析系統(tǒng)(Alpha innotech)，DYY-lOC型水平電泳槽(北京)，1-14型低溫高速離心機(sigma)。

1.1.3 微衛(wèi)星引物 這些引物的選擇是從已發(fā)表的文獻上獲取的。10對微衛(wèi)星引物均由上海生物工程技術公司合成，10對微衛(wèi)星引物信息見表1。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 采用常規(guī)酚-氯仿抽提法進行提取，配合使用全血基因組DNA提取試劑盒，檢測合格后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 10對微衛(wèi)星引物的的信息Table 1 Information of ten microsatellite primers

1.2.2 PCR反應條件 反應體系10 μL，其中模板DNA1μL(50～100 ng)，Go Taq PCR Master Mix,2×為5.0 μL，上游引物和下游引物均為1 μL，Nucleas-Free Water 2 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min，30 cycles(94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸1 min)，72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

1.2.3 擴增產物的檢測及電泳分型 取2.0 μL PCR擴增產物，加6倍稀釋的上樣緩沖液1 μL混勻，用2%瓊脂糖凝膠(GoodView染色)，并以Marker作對照，在5～8 v/cm電壓下電泳1 h，在凝膠成像系統(tǒng)中對照Marker觀察是否有所需條帶，對無帶和不在所需范圍的，重新擴增。有條帶的進行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測其片段大小。

1.3 統(tǒng)計分析

以分子量標記物(pBR322/MspⅠ)為標準，利用BandScan4.50分析軟件讀取各微衛(wèi)星位點的基因型和片斷大小，并用Cervus2.0軟件分析各位點的等位基因頻率、觀察雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、觀察等位基因數(Na)和多態(tài)信息含量(PIC)。用Popgen32計算有效等位基因數(Ne)及Nei's遺傳距離和相似度。采用SPASS17.0軟件包進行t檢驗，試驗數據以平均數±標準誤表示。

2 結果與分析

2.1 部分微衛(wèi)星位點聚丙烯酰胺凝膠電泳結果

微衛(wèi)星遵循孟德爾定律，呈共顯性遺傳。如果一個二倍體相對位點微衛(wèi)星核心重復數相同，則這個位點為純合基因型，反應在凝膠電泳片上是一條帶，即為純合子。若核心重復數不同，可能由堿基插入或缺失等原因，因而為雜合型，即為兩條帶，若無條帶出現則表明為無效等位基因。圖1為其中兩個位點在黑豬群體中的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜。

圖1 2個微衛(wèi)星位點聚丙烯酰胺凝膠電泳 Fig.1 Denatured polyacrylamide gel electrophoresis of two loci

注：上、下圖分別表示SWR308位點和SW787位點在不同黑豬個體間的擴增圖譜；其中，1-17：表示黑豬不同個體；M代表pBR322/MspⅠDNA Marker。

Note： The above two figures represent the PCR of different black pigs on the loci of SWR308 and SW787, in which 1-17 represent the different individuals of black pigs; M stands for pBR322/MspⅠDNA Marker.

2.2 等位基因及其頻率

南陽黑豬46個個體在10個微衛(wèi)星位點上共檢測116個等位基因，平均每個位點11.6個等位基因；在欒川黑豬30個個體共檢測88個等位基因，平均每個位點8.8個。南陽黑豬群體中，SW781位點上檢測到14個等位基因，為數目最多的，范圍在134～244 bp；欒川黑豬群體的S0090檢測基因數最多，達12個，變化范圍為230～338 bp；可見兩黑豬群體等位基因間存在較大差異(見表2)。

表2 兩黑豬群體10個微衛(wèi)星位點等位基因分析Table 2 The allele analysis of two black pig populations at 10 microsatellite loci

2.3 群體內遺傳變異分析

由表3可知，兩黑豬群體10個微衛(wèi)星位點均呈高度多態(tài)性(PIC>0.5)，范圍分別為0.834～0.904和0.753～0.896。其中，南陽黑豬群體中除S0090位點上多態(tài)性信息含量低于欒川黑豬群體外，其余均高于后者。觀察雜合度在兩群體間并無太大差異，多為1.000。10個位點中，兩黑豬群體的期望雜合度普遍低于觀察雜合度，南陽黑豬S0026位點的期望雜合度最低(0.861)，欒川群體中SW951位點為最低(0.796)。10個微衛(wèi)星位點在兩黑豬群體中均得到了較多的等位基因數，其中，南陽黑豬的SW781為最多，達到14個，而欒川黑豬群體中S0090位點高達12個。就有效等位基因數來說，南陽黑豬群體的多數位點高于欒川黑豬群體，二者變動幅度均較大，分別為6.73～11.20和4.42～10.47。

將兩黑豬群體的多態(tài)信息含量(PIC)、有效等位基因數(Ne)、觀察等位基因數(Na)和期望雜合度(He)分別進行t檢驗分析，并輸出P值，結果見表4。由表4可知，黑豬在10個位點的遺傳變異結果。

表3 兩黑豬群體在10個位點的遺傳變異結果Table 3 The genetic variation of two black pig populations at 10 microsatellite loci

表4 黑豬在10個位點的遺傳變異結果分析Table 4 The genetic variation analysis of black pig populations at 10 microsatellite loci

注：表中同行數據肩標大寫字母不同者表示差異極顯著(P<0.01)。

Note： Values with different capital letter superscripts in the same row show extreme difference (P<0.01).

2.4 群體間遺傳相似性指數和遺傳距離

遺傳相似系數是衡量群體間遺傳變異程度的可靠參數。親緣關系越近，則遺傳變異性越低，相似系數越大[12]。本研究依據10個微衛(wèi)星位點的等位基因頻率，運用Popgene32軟件計算了兩黑豬群體間的遺傳相似系數和Nei氏遺傳距離。結果顯示，南陽黑豬和欒川黑豬群體間遺傳相似系數為0.7317，遺傳距離為0.3124，兩群體間存在顯著遺傳分化。

3 討 論

3.1 黑豬群體內遺傳變異分析

等位基因是估計和比較遺傳多樣性及計算遺傳距離的最基本數據，也是衡量微衛(wèi)星座位多態(tài)性的一個重要參數。Baker等[13]提出每個微衛(wèi)星位點至少應該有4個等位基因才能較好的用于遺傳多樣性分析。本研究中兩黑豬群體的10個微衛(wèi)星位點中，等位基因數均在4個以上。等位基因值越大表明微衛(wèi)星位點的基因多態(tài)性越好，因此本試驗所選的10個微衛(wèi)星位點均為高度多態(tài)位點，可用于兩黑豬群體的遺傳變異分析。在同一個微衛(wèi)星位點上，等位基因數目和頻率的差異能反映出家畜品種內和品種間的差異，并可借此區(qū)分品種的類型；而基因頻率本身也可以反應出群體之間的遺傳相似度。由兩黑豬群體各位點間等位基因的顯著性差異可以看出，兩群體間的遺傳結構差異很大，且遺傳相似度較低。一些等位基因在南陽黑豬某一位點中頻率非常高，但在欒川黑豬群體同一位點中頻率較低或者沒有分布，顯然，這與兩黑豬群體的育種歷史及所處生態(tài)條件有關。

多態(tài)信息含量(PIC)是衡量基因變異程度高低，反映遺傳信息和基因豐度的一個指標。Botstein等[14]提出了衡量基因變異程度高低的指標，當PIC>0.5時，該位點為高度多態(tài)性位點；當0．25

群體的雜合度(H)又稱為基因多樣度，反映群體在多個基因位點上的變異，因而是度量群體遺傳變異的一個最適參數。[15]。就同一種標記來說，群體平均雜合度的高低反應了群體的遺傳一致性程度，群體雜合度越低，則群體的遺傳一致性越高，而群體的遺傳變異就越少，遺傳多樣性就越低。本研究中各位點雜合度均大于0.7，因而能很好的反應兩黑豬群體的遺傳多樣性。兩黑豬群體的平均觀察雜合度均高于平均期望雜合度，且差值較大，這表明兩群體處于不平衡狀態(tài)，或其群體內都存在一定程度的近交。兩群體的平均期望雜合度之間呈極顯著性差異，這種遺傳差異很可能與兩群體所處的生態(tài)環(huán)境以及人為重視程度等方面密切相關。

有效等位基因數(Ne)也是反映群體遺傳變異程度的重要指標，Hines等[16]指出等位基因在群體中的分布越均勻，則有效等位基因數就會越接近所檢測到的觀察等位基因數(Na)。而本研究中，兩黑豬群體的有效等位基因數均是只有個別與觀察等位基因數相近，大部分還是有差異的，由此可知，在這些基因座上，相應群體的等位基因分布并不均勻，造成這種不均勻的原因可能是基因的流動、自然環(huán)境的差異或者基因突變。南陽黑豬群體的平均有效等位基因數和平均觀察等位基因數在多數位點上均高于欒川黑豬，這一差異可能是由于欒川黑豬進行人為選育或改良時，基于一些性狀需求的選擇導致了某些位點上等位基因分布不均勻，從而失去了一些等位基因。但兩黑豬群體的平均有效等位基因數均很高，這說明在發(fā)生選擇、突變或遺傳漂變時，群體仍能有保持其等位基因的較強能力，而這也正是兩黑豬群體得以發(fā)展、延續(xù)的遺傳基礎。

3.2 黑豬群體間遺傳變異及地理分化

種群間遺傳變異通常是以等位基因頻率為基礎的遺傳距離來表示的，通過遺傳距離和遺傳相似性分析可以估測種群間的進化關系。Thorp[17]通過研究發(fā)現：不同物種間遺傳距離Ds=0.2～0.5，同科屬群體間Ds=0.5～0.9，同種群體間Ds=0.03～0.2；同種群體間遺傳相似系數I=0.80～0.97。本研究中，南陽黑豬和欒川黑豬群體間遺傳相似系數為0.7317，群體間遺傳距離為0.3124，表明兩黑豬群體間存在顯著的遺傳分化，因此推斷二者可能屬于不同的品種。

4 結 論

南陽黑豬與欒川黑豬兩群體均具有較高的遺傳變異,遺傳多樣性豐富，但欒川黑豬群體的遺傳多樣性略低于南陽黑豬的。

南陽黑豬與欒川黑豬在遺傳結構上存在顯著差異，且試驗結果顯示兩黑豬群體間遺傳相似度較低，遺傳距離較遠，兩群體間顯然產生了一定的遺傳分化，因而可能屬于不同的黑豬品種。

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