NaCl對匍匐剪股穎組織培養(yǎng)及 幼苗抗氧化酶的影響

錢 凱，鄧志瑞，陳 沁

(上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200444)

植物生產(chǎn)層

NaCl對匍匐剪股穎組織培養(yǎng)及幼苗抗氧化酶的影響

錢 凱，鄧志瑞，陳 沁

(上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200444)

以匍匐剪股穎(Agrostissoionifera)種子為材料，研究不同濃度(0、17、51、85、136、204和272 mmol·L-1)NaCl對匍匐剪股穎種子萌發(fā)率，愈傷組織誘導(dǎo)、生長、再生及再生幼苗過氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響。結(jié)果表明，隨著鹽濃度的升高，匍匐剪股穎種子發(fā)芽率，愈傷組織誘導(dǎo)率和分化率及幼苗再生率隨之下降，當(dāng)NaCl溶液濃度高達(dá)272 mmol·L-1時(shí)，完全抑制種子萌發(fā)；NaCl溶液濃度在204 mmol·L-1時(shí)，愈傷組織無法生長。在不同濃度NaCl處理下，匍匐剪股穎再生幼苗SOD活性先上升，達(dá)到最大值(83 U·g-1)之后降低；POD的活性變化與SOD相似，也是先上升，達(dá)到最大值(3 896 U·g-1)之后緩慢下降。

NaCl；匍匐剪股穎；愈傷組織；過氧化物酶；超氧化物歧化酶

鹽脅迫是指環(huán)境與生物之間由于滲透勢的不平衡而形成的對生物的一種脅迫。鹽漬除產(chǎn)生滲透脅迫外，還對植物產(chǎn)生離子脅迫，即離子毒害作用[1]。匍匐剪股穎(Agrostissoionifera)屬冷季型草坪草，草質(zhì)柔軟、細(xì)嫩，生長迅速，草坪優(yōu)美，觀賞性強(qiáng)，常用于高爾夫球場球道、發(fā)球區(qū)和果嶺等高品質(zhì)高強(qiáng)度管理的草坪[2]，但其抗病蟲害能力差且耐鹽性不理想。土壤鹽漬化是人類面臨的生態(tài)危機(jī)之一，鹽脅迫已成為影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)最重要的環(huán)境脅迫因子。孫天國和沙偉[3]以甜瓜(Cucumismelo)為材料，發(fā)現(xiàn)隨著鹽濃度的增大，甜瓜種子發(fā)芽率呈下降趨勢。在不同濃度的鹽脅迫處理下，甜瓜幼苗超氧化物歧化酶(SOD)活性先下降再升高，之后降低;過氧化物酶(POD)的活性先上升，之后緩慢下降。鹽濃度超過幼苗自身的忍耐程度時(shí)，會導(dǎo)致POD和SOD的活性均下降。蔡小東等[4]的研究表明，隨著鹽濃度的升高，柑橘(Citrusreticulata)愈傷組織生長量顯著下降，可溶性蛋白含量表現(xiàn)出先增加后減少的趨勢，可溶性糖和游離脯氨酸的含量顯著增加，而SOD和過氧化氫酶(CAT)活性均表現(xiàn)出先增強(qiáng)后減弱的變化趨勢。

目前關(guān)于匍匐剪股穎鹽脅迫效應(yīng)方面的研究較少，而研究鹽脅迫下匍匐剪股穎種子發(fā)芽率、愈傷組織誘導(dǎo)和分化及幼苗的再生情況，了解匍匐剪股穎抵御鹽脅迫的生理機(jī)制，對于培育耐鹽品種及建立匍匐剪股穎轉(zhuǎn)基因平臺具有重要的理論和實(shí)踐意義。鑒于此，本研究以匍匐剪股穎種子為材料，研究了鹽脅迫對匍匐剪股穎種子萌發(fā)特性以及愈傷組織發(fā)生、幼苗保護(hù)酶活性的影響，試圖在組織水平上探討匍匐剪股穎抵御鹽脅迫的生理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料 以匍匐剪股穎成熟種子為材料進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)試驗(yàn)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1NaCl對匍匐剪股穎種子發(fā)芽率的影響 用70%的乙醇浸泡種子5 min，無菌水清洗3次，再用體積分?jǐn)?shù)10%的次氯酸鈉滅菌90 min，無菌水清洗5次。將種子接種于添加了不同濃度NaCl溶液(0、17、51、85、136、204和272 mmol·L-1)的培養(yǎng)基上，每皿接種40～50粒于25 ℃條件下暗培養(yǎng)。

1.2.2NaCl對匍匐剪股穎愈傷組織誘導(dǎo)的影響 以1.2.1中的方法處理得到的對照組(0 mmol·L-1)萌發(fā)幼苗為材料，切取1 cm長的胚軸作外植體接種于上述不同濃度NaCl的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每兩周繼代一次，統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)頻率。

1.2.3NaCl對匍匐剪股穎愈傷組織分化及再生的影響 愈傷組織經(jīng)兩次繼代后，將狀態(tài)良好的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接到含1.0 mg·L-16-BA 和相應(yīng)濃度NaCl溶液的分化培養(yǎng)基上，于25 ℃光照條件下培養(yǎng)。待植株長至5 cm后，煉苗，并移栽至營養(yǎng)土中。

1.2.4NaCl對幼苗POD、SOD活性的影響 取不同鹽濃度下再生幼苗的鮮葉0.25 g，加入2.5 mL的0.2 mol·L-1磷酸緩沖液于冰上研磨成勻漿，15 000 r·min-1離心10 min，取上清備用。SOD活性測定參照鄒琦[5]方法，以每分鐘抑制NBT光還原50%為1個(gè)酶活單位。POD活性參照克熱木·伊力等[6]的方法測定，以ΔOD470(mg·min)表示。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)結(jié)果均為3次測定的平均值(n=3)，采用SPSS軟件進(jìn)行方差分析(one-way ANOVA)和Duncan多重比較檢驗(yàn)，并以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Excel 2003作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1NaCl對匍匐剪股穎種子發(fā)芽的影響 NaCl對匍匐剪股穎種子的萌發(fā)有抑制作用(圖1)。低濃度(17、51 mmol·L-1)鹽對匍匐剪股穎的發(fā)芽影響較小，而高濃度(136、204 mmol·L-1)鹽會延緩或抑制匍匐剪股穎種子的萌發(fā)，當(dāng)NaCl溶液濃度達(dá)到272 mmol·L-1時(shí)，完全抑制種子萌發(fā)。匍匐剪股穎種子的發(fā)芽結(jié)果表明，用17 mmol·L-1的NaCl處理時(shí)發(fā)芽率為57.1%，約為對照的70%；用204 mmol·L-1的NaCl處理時(shí)發(fā)芽率為2.0%，約為對照的2.5%(圖2)。

圖1 氯化鈉對匍匐剪股穎種子萌發(fā)的影響(15 d)Fig.1 Effect of NaCl on seed germination of creeping bentgrass(15 d)

圖2 氯化鈉對匍匐剪股穎種子發(fā)芽的影響Fig.2 Effect of NaCl on seed germination of creeping bentgrass

注：不同小寫字母表示處理間差異顯著(Plt;0.05)。下同。

Note:Different lower case letters indicate significant difference among different treatments at 0.05 level.The same below.

對照發(fā)芽最早且幼苗生長最快，用17 mmol·L-1的NaCl處理時(shí)芽長平均值為2.48 cm，約為對照的75%；用204 mmol·L-1的NaCl處理時(shí)平均芽長僅有0.64 cm，不到對照的20%。

由此可知，匍匐剪股穎發(fā)芽率和芽長隨著NaCl濃度的升高而顯著下降(Plt;0.05)。

2.2NaCl對匍匐剪股穎愈傷組織誘導(dǎo)的影響 萌發(fā)的幼苗接種于不同濃度NaCl的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，愈傷組織生長情況表明，不同濃度鹽對愈傷組織的形成有抑制作用(圖3)。鹽濃度愈高，抑制作用愈明顯。同一鹽濃度誘導(dǎo)培養(yǎng)25 d后的愈傷組織比15 d前有一定的增長，低鹽濃度(17、51 mmol·L-1)下愈傷組織有明顯的生長，高鹽濃度(85、136 mmol·L-1)下愈傷組織生長緩慢，當(dāng)鹽濃度為204 mmol·L-1時(shí)，愈傷組織幾乎不生長。

愈傷組織培養(yǎng)25 d后，統(tǒng)計(jì)不同鹽濃度下匍匐剪股穎愈傷組織的誘導(dǎo)情況和組織塊的大小，結(jié)果表明，鹽對愈傷組織的誘導(dǎo)和生長均有抑制作用(圖4)。用17 mmol·L-1的NaCl處理時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率為34%，約為對照的60%。當(dāng)NaCl濃度大于85 mmol·L-1時(shí)誘導(dǎo)率明顯降低，至204 mmol·L-1時(shí)到最低值(1%)，僅為對照的2%?？芍?，匍匐剪股穎愈傷組織的誘導(dǎo)頻率隨著鹽濃度的升高而顯著下降。

用17 mmol·L-1的NaCl處理時(shí)愈傷組織平均直徑最大為0.875 cm，相當(dāng)于對照的80%，用204 mmol·L-1的NaCl處理時(shí)平均直徑僅為0.3 cm，約是對照的25%。可知，隨著鹽濃度的升高，愈傷組織生長呈下降趨勢。

圖3 氯化鈉對愈傷組織誘導(dǎo)的影響Fig.3 Effect of NaCl on callus induction

注：A、B、C、D、E、F為培養(yǎng)15 d；G、H、I、J、K、L為培養(yǎng)25 d。

Note:A,B,C,D,E and F are cultured 15 days;G,H,I,J,K and L are cultured 25 days.

圖4 氯化鈉對愈傷組織誘導(dǎo)率和愈傷組織直徑的影響Fig.4 Effect of NaCl on callus induction rate and callus diameter

2.3NaCl對愈傷組織分化的影響 將上述愈傷組織繼代到含不同濃度NaCl的分化培養(yǎng)基上可知，NaCl在愈傷組織的分化過程中起抑制作用(圖5)，鹽濃度愈高抑制作用越明顯。對照愈傷組織分化速度最快，低濃度鹽(17、51 mmol·L-1)條件下的愈傷組織分化速度次之，高濃度鹽(85、136 mmol·L-1)條件下的愈傷組織分化速度較慢，當(dāng)NaCl濃度為204 mmol·L-1時(shí)愈傷組織不再分化。

2.4NaCl對愈傷組織再生的影響 將分化的愈傷組織分別移栽到含相應(yīng)濃度NaCl的營養(yǎng)土里，絕大多數(shù)能再生出綠苗，形態(tài)正常，生長狀態(tài)良好，且能形成大量叢生苗，其中對照尤為明顯(圖6)。隨著鹽濃度的升高，愈傷組織再生率不斷下降。NaCl濃度達(dá)到204 mmol·L-1時(shí)再生失敗，無綠色新苗長出。說明NaCl使愈傷組織的再生能力下降。

對不同鹽濃度條件下的愈傷組織再生率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明，隨著NaCl濃度的升高，愈傷組織再生率呈下降趨勢(圖7)。對照組再生率最大，為90%，用136 mmol·L-1的NaCl處理時(shí)再生率為30%，是最大值的1/3。鹽濃度為204 mmol·L-1時(shí)，愈傷組織無法再生幼苗。

2.5NaCl對幼苗POD、SOD活性的影響 不同鹽濃度下生長的再生幼苗葉片POD活性的變化整體過程是先上升后下降，用51 mmol·L-1的NaCl溶液處理時(shí)POD活性達(dá)到最大值(3 896 U·g-1)(圖8)。說明低濃度鹽脅迫可提高POD的活性，隨著處理濃度的增加，POD活力下降。不同濃度鹽溶液對SOD活性的影響與POD相似，活性的變化過程整體上是先上升后急劇下降，在NaCl溶液濃度為17 mmol·L-1時(shí)SOD活性達(dá)到最大值(83 U·g-1)。

圖5 氯化鈉對愈傷組織分化的影響Fig.5 Effect of NaCl on callus differentiation

注：A、B、C、D、E、F為培養(yǎng)5 d；G、H、I、J、K、L為培養(yǎng)15 d；M、N、O、P、Q、R為培養(yǎng)20 d。

Note:A,B,C,D,E and F are cultured 5 days;G,H,I,J,K and L are cultured 15 days;M,N,O,P,Q and R are cultured 20 days.

圖6 氯化鈉對愈傷組織再生的影響Fig.6 Effect of NaCl on callus regenerations

圖7 氯化鈉對植株再生率的影響Fig.7 Effect of NaCl on callus regeneration rate

3 討論與小結(jié)

鹽脅迫對匍匐剪股穎種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢有抑制作用，且隨著鹽濃度的升高抑制作用逐漸加強(qiáng)。這一試驗(yàn)結(jié)果與孫天國和沙偉[3]對甜瓜幼苗的研究的結(jié)果相似?？赡艿脑蚴歉邼舛鹊腘a+脅迫可使植物產(chǎn)生次級傷害，不僅抑制細(xì)胞呼吸，還能導(dǎo)致細(xì)胞生理性缺水[7]，而水分是種子萌發(fā)不可缺少的要素之一。毛秀紅等[8]認(rèn)為，鹽不僅產(chǎn)生滲透脅迫，而且能產(chǎn)生離子脅迫即單鹽毒害。Na+過多會造成培養(yǎng)基水勢降低，使種子吸收水分困難，細(xì)胞水分虧缺，呼吸受阻，并且容易造成生理缺水干旱，影響種子的萌發(fā)和幼苗的生長。

圖8 氯化鈉對幼苗POD和SOD活性的影響Fig.8 Effect of NaCl on POD and SOD activity

本試驗(yàn)結(jié)果表明，鹽脅迫對匍匐剪股穎愈傷組織的誘導(dǎo)和分化均有抑制作用，隨著鹽濃度的升高抑制作用逐漸加強(qiáng)。推測可能的原因是植物在鹽脅迫條件下，各種氨基酸、可溶性蛋白質(zhì)、離子和脯氨酸等含量發(fā)生了顯著的變化[9]，從而影響了細(xì)胞的正常新陳代謝，使愈傷組織的誘導(dǎo)受到抑制。而且Na+的脅迫會破壞滲透平衡和細(xì)胞質(zhì)膜的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞膜選擇透過性下降甚至喪失，細(xì)胞內(nèi)離子失調(diào)，引發(fā)一系列代謝紊亂，從而阻止細(xì)胞分裂、增殖以及分化，使愈傷組織在鹽脅迫下由于滲透脅迫和離子毒害而生長減緩[10]。

鹽脅迫對匍匐剪股穎愈傷組織的再生也有抑制作用，隨著NaCl濃度的升高，愈傷組織再生率呈下降趨勢。可能是因?yàn)檫^量的Na+、Cl-滲入植物細(xì)胞內(nèi)，破壞了離子平衡并瓦解膜電勢，使細(xì)胞原生質(zhì)凝集，同時(shí)破壞蛋白質(zhì)合成，加快蛋白質(zhì)水解，使蛋白質(zhì)含量降低，而蛋白質(zhì)合成是器官發(fā)生所必須的[11]。

Kalir和Poliakoff-Mayber[12]證明鹽害與自由基傷害有關(guān)。本試驗(yàn)的結(jié)果表明，不同鹽濃度處理使POD和SOD活性先上升后下降，高濃度鹽脅迫超過了愈傷組織自身的忍耐程度時(shí)，POD和SOD的活性下降。這一試驗(yàn)結(jié)果與克熱木·伊力等[6]對阿月渾子(Pistaciavera)的研究結(jié)果相似。分析其中的原因可能是鹽脅迫引發(fā)細(xì)胞內(nèi)活性氧的過量生產(chǎn)、積累而打破了平衡。 許多有關(guān)鹽脅迫對植物傷害的研究結(jié)果表明，活性氧介導(dǎo)了膜脂的過氧化作用[13-16]，從而使細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能都受到破壞。植物對脅迫的響應(yīng)之一就是保護(hù)酶活性的變化，而植物體內(nèi)的POD、SOD 在消除超氧化物自由基、減輕脂質(zhì)過氧化作用和膜傷害方面起著重要作用[17]。在鹽脅迫下雖然保護(hù)酶活性加強(qiáng)，但其調(diào)節(jié)能力也是有限的[18]，當(dāng)逆境脅迫嚴(yán)重時(shí)，將導(dǎo)致植物死亡[19]。綜上所述，鹽脅迫不僅抑制種子萌發(fā)，愈傷組織誘導(dǎo)、分化和再生，而且影響幼苗SOD、POD的活性。

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EffectsofNaclonthetissuecultureofcreepingbentgrassandantioxidantenzymeactivities

QIAN Kai, DENG Zhi-rui, CHEN Qin

(College of Life science, Shanghai University, Shanghai 200444, China)

Effects of different NaCl concentration(0，17，51，85，136，204 and 272 mmol·L-1)on creeping bentgrass (Agrostissoionifera) seed germination rate, callus formation, growth, plantlet regeneration and POD and SOD activities of regenerated seedlings were studied using creeping bentgrass seeds. The results showed that creeping bentgrass germination rate, callus induction rate and differentiation rate and seedling regeneration rate decreased with NaCl concentration increasing gradually. When NaCl concentration was above 272 mmol·L-1，seed germination was inhibited completely. When NaCl concentration was 204 mmol·L-1, calluses were not able to grow at all. Under salt stress, SOD activity of creeping bentgrass regenerated seedlings rose to the maximum value of 83 U·g-1and then declined. Changes of POD activity were similar to SOD activity.

NaCl; creeping bentgrasses; callus; POD; SOD

CHEN Qin E-mail:chenqincc@staff.shu.edu.cn

S540.1;Q944.6

A

1001-0629(2013)10-1548-07

2013-01-16 接受日期：2013-03-07

上海市教育委員會科研創(chuàng)新項(xiàng)目暨上海大學(xué)創(chuàng)新基金(A.10-0112-10-004) 作者簡介:錢凱(1990-)，男，浙江湖州人，在讀碩士生，主要從事逆境生理研究。E-mail:731784508@qq.com

陳沁(1970-)，女，江蘇江都人，教授，博士，主要從事分子生物學(xué)研究。E-mail:chenqincc@staff.shu.edu.cn