黃連素抑制腎腺癌細胞增殖及其分子機制

相 芳，相 紅，朱月蓉，嚴 婷

(1.解放軍第八一醫(yī)院 藥劑科，江蘇 南京 210002;2.江蘇省軍區(qū)第一干休所 門診部，江蘇 南京 210037;3.解放軍第八一醫(yī)院 檢驗科，江蘇 南京 210002;4.南京醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院 衛(wèi)生分析檢測中心，江蘇 南京 210029)

黃連素(berberine)又稱小檗堿，是從毛莨科黃連根狀莖中提取的一種季胺類化合物，屬于異喹啉生物堿?，F(xiàn)已能夠人工合成，具有抗菌譜較廣、毒性和副作用較小等特點，主要用于腸道炎癥。近年研究發(fā)現(xiàn)其有多方面的抗癌活性，其抗癌的機制主要有:抑制激活蛋白-1和尿激酶型纖溶酶原激活因子的活性;抑制環(huán)氧合酶-2活性;抑制N-乙?；富钚?阻滯細胞周期;抑制腫瘤生長促進劑的作用等。

黃連素在體外對宮頸癌Hela細胞具有生長抑制作用，并可誘導細胞凋亡，其誘導凋亡作用可能與Bcl-2蛋白表達下調(diào)有關［1］。黃連素可以增強自殺基因系統(tǒng)對直腸癌細胞的殺傷作用，可作為一種增效劑應用于直腸癌的治療［2］。黃連素能夠抑制非小細胞肺癌細胞 A549的遷移和黏附能力［3］。目前，黃連素在腎腺癌細胞發(fā)生和發(fā)展過程中的確切調(diào)控機制尚不清楚。腎腺癌的發(fā)生和惡化與腎腺癌細胞的增殖密切相關，我們推測黃連素可能通過抑制腎腺癌細胞的增殖而起到防治腎腺癌的作用。因此，本研究著重觀察黃連素對人腎癌細胞ACHN增殖的影響，并探討其分子機制，為揭示腎腺癌發(fā)病機制和可能的藥物治療方案提供新的細胞學證據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 黃連素(Sigma，美國)，鼠抗 caspase 3單克隆抗體(南通碧云天，中國)，兔抗人c-Fos多克隆抗體(Abcam，美國)，鼠抗 β-actin單克隆抗體、lgG-HRP(上海康成，中國)，ECL發(fā)光試劑盒(Pierce，美國)。細胞培養(yǎng)箱(上海一恒，中國)，PCR儀(北京東勝，中國)，電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀和成像系統(tǒng)(北京六一，中國)，酶標儀(上海精密，中國)。

ACHN人腎腺癌細胞購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫，細胞培養(yǎng)使用添加10%(v/v)新生牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于5%CO2、常氧(20%O2)、飽和濕度的37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測細胞增殖 將腎腺癌ACHN細胞鋪至96孔板，每孔1×103個細胞。血清饑餓24 h后加入相應濃度的黃連素處理24或48 h，藥物處理后各孔加入MTT(500 mg/L)100 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清，加入二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)200 μl，搖床上輕輕振蕩待甲臜沉淀完全溶解。酶標儀檢測A490，利用A490數(shù)值代表存活細胞數(shù)繪制數(shù)值曲線。

1.2.2 蛋白提取和Western blot分析 RIPA蛋白裂解液裂解腎腺癌細胞后提取總蛋白，BCA比色法測定蛋白濃度。將蛋白煮沸5 min使其變性，取等量蛋白進行SDS-PAGE電泳，電泳條件為80 V電泳20～30 min，待溴酚藍遷移出積層膠位置再換用100 V電泳90 min，電泳完畢后將蛋白經(jīng)濕電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，抗β-actin抗體(1∶5 000)、抗 caspase 3抗體(1∶2 000)或抗 c-Fos抗體(1∶1 000)4℃孵育過夜，TBST洗膜，lgG-HRP(1∶5 000)室溫孵育2 h，TBST洗膜，暗室中加入ECL液孵育8 min后，利用凝膠電泳成像系統(tǒng)進行讀片分析。

1.2.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 11.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量結(jié)果采用均數(shù)±標準差表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05表示有統(tǒng)計學差異。每組實驗獨立重復3次。

2 結(jié)果

2.1 黃連素抑制腎腺癌細胞的增殖 用MTT法檢測黃連素處理后腎腺癌細胞增殖的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表1)，10 μmol/L黃連素處理24 h后，代表細胞存活數(shù)量的A490值(0.485±0.014)顯著低于未加黃連素組(0.622 ± 0.075)及5 μmol/L黃連素組(0.617 ±0.036);20 μmol/L 黃連素處理 24 h 后，A490值(0.401±0.019)也顯著低于未加黃連素組及5 μmol/L黃連素組;10 μmol/L 黃連素處理 48 h后，A490 值(0.404 ±0.027)顯著低于未加黃連素組(0.783 ± 0.0195)及 5 μmol/L 黃連素組(0.73 ±0.04);20 μmol/L 黃連素處理 48 h 后，A490 值(0.397±0.022)也顯著低于未加黃連素組及5 μmol/L黃連素組。結(jié)果說明，低劑量(5 μmol/L)的黃連素不影響腎腺癌細胞增殖，較高劑量(10 μmol/L和20 μmol/L)的黃連素能夠抑制腎腺癌細胞增殖。

表1 黃連素抑制腎腺癌細胞ACHN的增殖Tab 1 Berberine inhibiting the growth of ACHN cell line

2.2 黃連素不誘導腎腺癌細胞的凋亡 10 μmol/L黃連素處理腎腺癌細胞24 h和48 h后，用caspase 3抗體檢測細胞的凋亡，Western blot結(jié)果未見明顯的剪切后的 caspase 3(Cleaved-caspase 3)。結(jié)果說明，黃連素不誘導腎腺癌細胞的凋亡(圖1)。

圖1 黃連素不誘導腎腺癌細胞ACHN的凋亡Fig 1 Berberine failed to induce apoptosis of ACHN cell line

2.3 黃連素誘導腎腺癌細胞c-Fos表達下降 10 μmol/L黃連素處理腎腺癌細胞24 h后，用Western blot方法檢測c-Fos的表達。結(jié)果顯示，黃連素顯著抑制了c-Fos的表達(圖2)。該結(jié)果提示，黃連素抑制腎腺癌細胞的增殖可能通過下調(diào)c-Fos的表達來實現(xiàn)。

圖2 黃連素誘導腎腺癌細胞c-Fos表達下降Fig 2 Berberine inhibiting the expression of c-Fos in ACHN cell line

3 討論

黃連素作為抗菌藥在臨床上已應用多年，其療效確切，是一種廣譜抗菌藥物，對多種格蘭陽性和陰性菌以及真菌、霉菌、病毒、原蟲、線蟲具有抑制或殺滅作用。近年研究還表明，黃連素具有抗腫瘤作用，可誘導多種腫瘤細胞凋亡［4］。黃連素對人宮頸癌Hela細胞株的體外作用的研究發(fā)現(xiàn)，黃連素在體外對Hela細胞產(chǎn)生細胞毒作用并誘導其凋亡;免疫細胞化學法證實黃連素作用Hela細胞后Bcl-2蛋白表達下調(diào)，COX-2的表達無明顯變化。由此說明，黃連素在體外對宮頸癌Hela細胞具有生長抑制作用，并可誘導細胞凋亡，其誘導凋亡作用可能與Bcl-2蛋白表達下調(diào)有關［5］。黃連素對甲狀腺癌8505C和TPC1細胞株的體外作用的研究發(fā)現(xiàn)，黃連素有效的誘導甲狀腺癌細胞的凋亡，而甲狀腺癌細胞的凋亡可能是由于p-27表達上調(diào)引起的［6］。有人探討黃連素聯(lián)合腺病毒介導的胞嘧啶脫氨酶自殺基因(Ad-CD)對直腸癌細胞的體外殺傷作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃連素可以增強自殺基因系統(tǒng)對直腸癌細胞的殺傷作用，可作為一種增效劑應用于直腸癌的治療［7］。本研究發(fā)現(xiàn)，較高劑量(10～20 μmol/L)的黃連素在體外對腎癌細胞ACHN的增殖有明顯的抑制作用，而低劑量(5 μmol/L)的黃連素不影響腎癌細胞ACHN的增殖。進一步研究發(fā)現(xiàn)，10 μmol/L黃連素并不誘導腎癌細胞ACHN的凋亡，只影響腎癌細胞的增殖。該結(jié)果和黃連素對甲狀腺癌細胞的作用有不同之處［6］，說明黃連素對不同腫瘤增殖的抑制作用的機制不一致。

C-Fos基因是存在于人類、豚鼠和鳥類細胞核中的基因片段，這一因子可識別特定的DNA序列來啟動細胞的增殖和分化。C-Fos可與c-Jun蛋白結(jié)合，引起多種原癌基因的轉(zhuǎn)錄，進而誘導腫瘤的發(fā)生和惡化［8］。Oya等發(fā)現(xiàn)，c-Fos和 c-Jun蛋白復合物參與腎癌細胞增殖的調(diào)控［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，10 μmol/L黃連素處理腎癌細胞ACHN后，其c-Fos的表達量明顯下調(diào)。本結(jié)果提示，黃連素抑制腎癌細胞ACHN的增殖可能是通過下調(diào)c-Fos的表達量來實現(xiàn)的，并驗證了我們的假設，即黃連素可通過抑制腎腺癌細胞的增殖達到防治腎腺癌的目的。同時說明，c-Fos在腎癌增殖過程中可能起著十分重要的作用，但c-Fos在調(diào)控腎癌細胞增殖中的確切分子機制尚不清楚，需要進一步研究其下游靶標分子。

黃連素對腫瘤防治的作用，除了增殖外，可能還對遷移、黏附等起作用。史海嶺等研究對黃連素作用后的肺腺癌A549細胞的增殖、遷移及黏附能力進行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃連素能夠抑制A549細胞的遷移和黏附能力，其機制可能與下調(diào)MMP2和MMP9的mRNA表達，從而降低其活性有關［3］。黃連素對腫瘤防治的作用是多方面的，黃連素對防止腎癌惡化的作用可能不僅僅抑制其增殖。我們需要進一步研究黃連素對防止腎癌惡化的多重作用，以期找到全面防治腎癌發(fā)生和惡化的方法。

［1］狄曉鴻，高英敏，郭紅云.黃連素對人宮頸癌Hela細胞株的體外作用研究［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2008，15(1):31 －34.

［2］劉曾旭，余慶，馬學強，等.腺病毒介導胞嘧啶脫氨酶基因聯(lián)合黃連素對直腸癌細胞的殺傷作用［J］.解剖學雜志，2009，32(5):635－638.

［3］史海嶺，劉芬，郭曉軍，等.黃連素對肺腺癌A549細胞增殖、遷移與黏附的影響［J］.中國癌癥雜志，2009，19(12):910 －914.

［4］TAN W，LU J，HUANG M，et al.Anti-cancer natural products isolated from chinese medicinal herbs［J］.Chinese Medicine，2011，6:27.

［5］狄曉鴻，高英敏，郭紅云.黃連素對人宮頸癌Hela細胞株的體外作用研究［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2008，15(1):31 －33.

［6］PARK KS，KIM JB，BAE J，et al.Berberine inhibited the growth of thyroid cancer cell lines 8505C and TPC1［J］.Yonsei Med J，2012，53(2):346 －349.

［7］劉曾旭，余慶，馬學強，等.腺病毒介導胞嘧啶脫氨酶基因聯(lián)合黃連素對直腸癌細胞的殺傷作用［J］.解剖學雜志，2009，32(5):635－638.

［8］WAGNER EF.Bone development and inflammatory disease is regulated by AP-1(Fos/Jun)［J］.Ann Rheum Dis，2010，Suppl 1:186－189.

［9］OYA M，MIKAMI S，MIZUNO R，et al.C-jun activation in acquired cystic kidney disease and renal cell carcinoma［J］.J Urol，2005，174(2):726 －730.