人精子膜抗原的提取及分析

湯興麗，王 萍

(皖南醫(yī)學(xué)院 微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

研究表明，人類(lèi)精子膜抗原能影響精子的受精功能和胚胎的發(fā)育，與生育密切相關(guān)［1］，精子膜抗原的研究有利于生殖免疫，生殖生理，以及免疫不孕和免疫避孕的研究。精子膜抗原的提取是上述研究的基礎(chǔ)。提取精子膜抗原的方法有很多種，本實(shí)驗(yàn)室主要選用尿素裂解液和TDOC裂解液提取了精子膜抗原，同時(shí)進(jìn)行SDS-PAGE分析比較，為進(jìn)一步應(yīng)用精子膜抗原檢測(cè)精子抗體的研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 精液 來(lái)源于皖南醫(yī)學(xué)院生育與不孕不育研究所，參照WHO正常標(biāo)準(zhǔn)［2］，選用新鮮液化的精液樣本，精子密度≥20×109/L，活率≥70%，活力良好，精液量≥2 ml，pH 7.2 ～7.8，精漿及血清抗精子抗體(AsAb)陰性。

1.1.2 主要試劑 二硫蘇糖醇(DTT)為Merck公司產(chǎn)品，Triton X-100為SIGMA公司產(chǎn)品，脫氧膽酸鈉(DOC)為上海藍(lán)季科技公司產(chǎn)品，苯甲磺酰氟(PMSF)、丙烯酰胺、四甲基乙烯二胺(TEMED)、2×SDS還原性樣品緩沖液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒均為BOSTER公司產(chǎn)品，過(guò)硫酸銨(APS)為國(guó)藥集團(tuán)化劑公司產(chǎn)品，考馬斯亮藍(lán)R-250購(gòu)自合肥安啟公司，蛋白質(zhì)marker為Fermentas產(chǎn)品。

1.1.3 EPS300垂直電泳槽(上海天能科技有限公司)，TGL 16M高速冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司)，uV-7502 PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海欣茂儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 尿素裂解液提取法［3］將4份新鮮液化的精液混合，加等量生理鹽水，1 500 r/min離心10 min，重復(fù)3次，上清收集為精漿，留取沉淀加2 ml尿素裂解液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，100 mmol/L DTT)，然后加 100 mmol/L PMSF 40 μl，于4℃冰箱放置1 h后12 000 r/min 4℃離心10 min，收集上清分裝，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 TDOC裂解液提取法 將4份新鮮液化的精液混合，加等量生理鹽水，1 500 r/min離心10 min，重復(fù)3次，取精子沉淀加2 ml TDOC緩沖液(1%Triton X-100，10 g/L DOC，0.05 mol/L NaCl，0.02 mol/L Tris，)，然后加 100 mmol/L PMSF 40 μl，4℃冰箱放置1 h，然后12 000 r/min 4℃離心10 min，收集上清分裝，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 上樣緩沖液處理 所提抗原按1∶1與2×SDS還原性樣品緩沖液混勻，100℃ 5 min，處理好的樣品可置4℃冰箱備用。

1.2.4 BCA法檢測(cè)蛋白濃度 按BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒操作步驟進(jìn)行，用uV-7502PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度。

1.2.5 SDS-PAGE分析 分離膠12%(30%丙烯酰胺 4 ml，去離子水 3.3 ml，1.5 mol/L pH 8.8 Tris-HCl 2.5 ml，10%SDS 100 μl，10%APS 100 μl，TEMED 5 μl)濃縮膠 5%(30% 丙烯酰胺 0.4 ml，去離子水 1.7 ml，1 mol/L pH 6.8 Tris-HCl 0.3 ml，10%SDS 25 μl，10%APS 25 μl，TEMED 3 μl)，每孔加樣品及標(biāo)準(zhǔn)蛋白均12 μl，濃縮膠電壓90 V，分離膠電壓140 V。分離膠用考馬斯亮藍(lán)R250染色1.5 h，脫色過(guò)夜，直至顯示清晰電泳圖譜，根據(jù)蛋白質(zhì)marker測(cè)定蛋白質(zhì)分子量。

2 結(jié)果

2.1 所提蛋白質(zhì)的濃度測(cè)定結(jié)果 TDOC裂解液法﹑尿素裂解液法提取的蛋白質(zhì)濃度分別為1.35 mg/ml，970 mg/ml，精漿蛋白質(zhì)濃度為 39.2 mg/ml。

2.2 SDS-PAGE結(jié)果 SDS-PAGE分析顯示TDOC裂解液提取的蛋白接近100 ku處較聚集，尿素裂解液提取的蛋白共有18條帶，分子質(zhì)量主要在130 ku以下，蛋白條帶多而細(xì)，130～100 ku一條帶，100～70 ku三條帶，70～55 ku四條帶，55～40 ku四條帶，40～35 ku兩條帶，35～25 ku兩條帶，25～15 ku兩條帶，其中主要條帶為130～100 ku，70～55 ku，55 ～40 ku，25 ku，25 ～15 ku(見(jiàn)圖1)。

2.3 與精漿抗原對(duì)比結(jié)果 精漿抗原同時(shí)進(jìn)行了SDS-PAGE分析，顯示有6條蛋白聚集帶，依次為170 ～130 ku，100 ～70 ku，70 ku，55 ～40 ku，40 ku，35 ku。對(duì)比可見(jiàn)尿素裂解液提取的蛋白明顯多于TDOC裂解液提取的蛋白，主要的蛋白條帶與精漿抗原不同。

3 討論

精子含有多種抗原，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，種類(lèi)繁多，按抗原的分布部位，可分為精子膜抗原，核抗原和頂體抗原［4］。精子抗原特別是膜抗原涉及精子獲能、精卵識(shí)別、頂體反應(yīng)、穿過(guò)透明帶、精卵融合等多方面，是精子發(fā)生、成熟過(guò)程的重要標(biāo)志分子，與受精和胚胎的早期發(fā)育關(guān)系密切［5］。在某些情況下如發(fā)生生殖感染、創(chuàng)傷和阻塞導(dǎo)致生殖道免疫屏障破壞、免疫抑制物質(zhì)缺失時(shí)，精子膜抗原可誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗體，影響精子的受精能力，從而導(dǎo)致免疫性的不孕不育或流產(chǎn)等情況的發(fā)生［6］。深入研究精子膜抗原揭示受精過(guò)程和不育機(jī)制，有助于研究相關(guān)抗體及研發(fā)相關(guān)避孕疫苗，提高生育質(zhì)量。

圖1 SDS-PAGE分析結(jié)果1.蛋白質(zhì)marker;2.TDOC裂解液法提取物;3.精漿蛋白質(zhì);4.尿素裂解液法提取物Fig 1 Results of SDS-PAGE determination1.Protein marker;2.The extracts by TDOC lysis buffer;3.Seminal plasma protein;4.The extracts by urea lysis buffer

提取精子膜抗原的方法有很多種，傳統(tǒng)的方法有反復(fù)凍融法、超聲震蕩裂解法等［7］，現(xiàn)在不常使用。本次試驗(yàn)收集新鮮的精液樣本采用兩種裂解液提取精子膜抗原，TDOC裂解液中Triton X-100和DOC能大量結(jié)合膜脂深層的蛋白質(zhì)，提取的蛋白主要為精子膜抗原［8］。尿素裂解液中DTT是一種很強(qiáng)的還原劑，還原蛋白質(zhì)中的二硫鍵，阻止蛋白質(zhì)中的半胱氨酸之間形成蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間二硫鍵，破壞蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)，使之變性釋放，硫脲則能增加蛋白的溶解能力，使蛋白質(zhì)大量釋放，苯甲磺酰氟能抑制酶對(duì)蛋白質(zhì)的破壞［9］，經(jīng)過(guò)裂解液處理后選擇在4℃，12 000 r/min離心10 min，可有效防止蛋白降解流失。結(jié)果SDS-PAGE顯示TDOC裂解液提取的蛋白僅一處聚集帶，不同于沙國(guó)柱等［7］人的報(bào)道，可能是在裂解蛋白的同時(shí)導(dǎo)致了部分蛋白尤其是小分子蛋白的降解［10］。尿素裂解法提取的蛋白較多，且方法簡(jiǎn)便，為抗精子抗體的進(jìn)一步研究提供條件。

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