粉塵螨主要變應原基因Der f 1和Der f 3改組的研究

姜玉新，郭 偉，馬玉成，劉志明，陳 琪，李朝品

(皖南醫(yī)學院 1.生理學教研室，2.醫(yī)學寄生蟲學教研室，安徽 蕪湖 241002)

過敏性疾病(變態(tài)反應性疾病)被WHO認為是當前世界性的重大衛(wèi)生學問題之一，總發(fā)病率為10% ～30%，并呈逐年增加的趨勢，其中以粉螨為致敏原引起的慢性氣道炎癥所致的螨性過敏性哮喘尤為常見［1］，主要包括麥食螨科(Pyroglyphidae)的屋塵螨(Dermatophagoides pteronyssinus)、粉塵螨(Dermatophagoides farinae)和梅氏嗜霉螨(Euroglyphus maynei)等，其中1、2、3類變應原是誘導哮喘與變態(tài)反應性疾病的最重要變應原［2］。變應原特異性免疫治療(allergen special immunotherapy，ASIT)是目前唯一可改變變態(tài)反應性疾病自然進程的病因療法［3］。重組變應原疫苗與天然變應原浸液相比，不僅降低患者變應原特異性IgE的反應性，同時也保留了T細胞的活性表位，因此具有高免疫原性和低變應原性的特點。DNA改組(DNA shuffling)技術(shù)，也稱有性PCR(sexual PCR)、分子育種(molecular breeding)，該技術(shù)通過改變單個基因或基因家族(gene family)原有的核苷酸序列創(chuàng)造新的基因，并賦予表達產(chǎn)物以新功能［4］。如應用DNA shuffling技術(shù)可提高綠色熒光蛋白的熒光強度［5］、抗體的表達水平和親和性［6］、枯草菌素E的熱穩(wěn)定性［7］以及干擾素的抗病毒作用［8］等。但應用DNA shuffling技術(shù)來改組粉塵螨主要變應原Der f 1和Der f 3基因并獲得重組基因尚未見報道。本研究探索在不同酶切條件下，應用DNA改組技術(shù)對粉塵螨變應原基因Der f 1和Der f 3間進行基因重組，以期獲得突變?nèi)诤匣?，為制備高效低價的哮喘疫苗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 粉塵螨 從蕪湖某面粉廠的地角粉中分離獲得，經(jīng)形態(tài)學鑒定證實為粉塵螨，分離純化并進行大規(guī)模培養(yǎng)。

1.1.2 引物 根據(jù)GenBank公布的粉塵螨Der f 1(Accession number:EU095368.1)、Der f 2(Accession number:FJ436110.1)和Der f 3 cDNA(Accession number:FJ436101.1)序列分別設計三對特異性引物，由生工生物工程(上海)有限公司合成。引物序列如下:Der f 1上游引物:AGC GCT TGC CGT ATC AAT TCG GTT，Der f 1下游引物:GAG GTT GTT TCC GGC TTG GAA ATA;Der f 2上游引物:ATT TCC AAA ATC TTG TGC CT，Der f 2下游引物:TTA ATC ACG GAT TTT ACC ATG GG;Der f 3上游引物:ACT ATC GAT AAT GAT GTT GCA TT，Der f 3 下游引物:CTG TGA ACG TTT TGA TTC AAT CC，由生工生物工程(上海)有限公司合成。擴增片段長度分別為 627 bp、438 bp、456 bp。

1.1.3 工具酶 Taq DNA聚合酶購自生工生物工程(上海)有限公司;DNaseⅠ購自Promega公司。

1.1.4 主要試劑 Trizol?購自Invitrogen公司;MMLV first strand cDNA synthesis Kit購自BBI(加拿大)公司;SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、PCR擴增試劑盒、SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒、100 bp DNA ladder購自生工生物工程(上海)有限公司;瓊脂糖購自Amresco公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.5 主要儀器 ABI2720型PCR儀、Beckman高速冷凍離心機、賽多利斯電子天平、Bio-Rad水平電泳儀、水浴鍋、超凈工作臺、細菌培養(yǎng)箱、ImageMas terTM凝膠電泳成像分析系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 Der f 1、Der f 2和Der f 3基因的克隆 500只粉塵螨用Trizol?一步法提取其總RNA，以此為模板進行反轉(zhuǎn)錄獲得其cDNA，按照說明書操作。以反轉(zhuǎn)錄獲得的 cDNA為模板，進行PCR擴增，50 μl反應體系如下:cDNA 2 μl，10 × Ex Taq Buffer 5 μl，2.5 mmol/L dNTP 4 μl，Der f 1(Der f 2/Der f 3)上游引物1 μl(20 pmol/μl)，Der f 1(Der f 2/Der f 3)下游引物 1 μl(20 pmol/μl)，Ex Taq 酶 0.5 μl(5 U/μl)，ddH2O 36.5 μl;PCR 反應條件:94 ℃ 變性4 min，94 ℃變性20 s，52 ℃ 復性30 s，72 ℃ 延伸1 min，進行35個循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳，ImageMasterTM電泳成像裝置觀察并拍照，所獲序列由生工生物工程(上海)有限公司測序。

1.2.2 Der f 1和Der f 3基因的同源性分析 使用DNAMAN軟件，對獲得的Der f 1和Der f 3基因序列進行同源性分析。

1.2.3 DNaseⅠ的消化 純化后Der f 1 PCR產(chǎn)物1 μl，用DNaseⅠ進行酶切，室溫(22℃)下分別反應10、15、20、25 和 30 min，65 ℃酶滅活。同樣條件下分別酶切Der f 3基因，酶切產(chǎn)物分別行1.0%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.4 DNA改組 無引物PCR:100 μl PCR體系(10 × Buffer 10 μl，MgCl27 μl，dNTPs 1 μl，Der f 1 和Der f 3酶切相同時間產(chǎn)物各2 μl混勻，Taq DNA聚合酶 1 μl，ddH2O 78 μl)反應條件:94 ℃變性 1 min后，94℃1 min，52℃1 min，72℃1 min進行35個循環(huán)，72℃延伸2 min。PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠進行電泳并拍照。

有引物PCR:100 μl PCR體系(10×緩沖液10 μl，MgCl27 μl，dNTPs 1 μl，上述無引物 PCR 產(chǎn)物模板 2 μl，Taq DNA 聚合酶 1 μl，上下游引物(組合見表 1)各 1 μl，ddH2O 78 μl)94 ℃ 變性 4 min，94 ℃1 min，52℃1 min，72℃1 min進行35個循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳并拍照。

2 結(jié)果

2.1 Der f 1、Der f 2和Der f 3的PCR結(jié)果 RTPCR結(jié)果表明:Der f 1、Der f 2、Der f 3均出現(xiàn)清晰條帶，大小分別為 627 bp、438 bp、456 bp，與預期值相一致(圖1);測序后應用DNAMAN軟件分析表明，Der f 1和Der f 3基因的同源性為32.33%(圖2)。

圖1 Der f 1、Der f 2和Der f 3的PCR擴增結(jié)果M:DNA分子量標準;1～3:分別為Der f 1、Der f 2和Der f 3的PCR產(chǎn)物Fig1 PCR products of Der f 1，Der f 2 and Der f 3M:DNA ladder;1-3:PCR products of Der f 1，Der f 2 and Der f 3，respectively

圖2 Der f 1和Der f 3核苷酸序列比對Fig 2 Nucleotide sequence alignment of Der f 1 and Der f 3

2.2 不同酶切時間的酶切效果 將Der f 1和Der f 3基因PCR產(chǎn)物各1 μl用DnaseⅠ分別酶切10、15、20、25、30 min，電泳結(jié)果顯示，PCR 產(chǎn)物均被切斷，說明酶切效果較好(圖3)。

圖3 Der f 1和Der f 3基因不同酶切時間的電泳結(jié)果M:100 bp DNA 分子量標準;10、15、20、25、30 min 表示不同酶切時間Fig 3 Results of different digested times of Der f 1 and Der f 3 by DnaseⅠM:100 bp DNA ladder;10，15，20，25，30 min represent different cut time using DnaseⅠ

2.3 無引物PCR結(jié)果電泳分析 分別將酶切10、15、20、25、30 min的 Der f 1 和 Der f 3 基因 PCR 產(chǎn)物各1 μl對應進行混合(即酶切時間相同的PCR產(chǎn)物混合)，并進行無引物PCR擴增(不加任何引物，根據(jù)基因酶切片段的同源性進行重組)，電泳結(jié)果顯示，雖然仍無目的條帶產(chǎn)生(理論值在438 bp～627 bp之間)，但其亮度已增強(圖4)，說明無引物PCR已產(chǎn)生大量的重組條帶。

2.4 不同引物PCR擴增電泳分析 分別以不同酶切時間的無引物PCR產(chǎn)物為模板，以不同的引物(包括 Der f 1 F、Der f 1 R、Der f 2 F、Der f 2 R、Der f 3 F和Der f 3 R)進行PCR擴增，研究結(jié)果表明:以Der f 1 F和Der f 1 R、Der f 1 F和Der f 2 R、Der f 1 F和Der f 3 R為引物分別在酶切10 min、15 min、20 min、25 min、30 min 均無條帶出現(xiàn)(圖 5);以 Der f 2 F和Der f 2 R為引物在酶切15 min、20 min、25 min和30 min的模板中擴增出清晰的PCR片段，以Der f 2 F和Der f 3 R為引物僅在酶切10 min、15 min、25 min擴增出模糊條帶，Der f 2 F和Der f 1 R為引物在酶切 10 min、15 min、20 min、25 min、30 min 均無條帶出現(xiàn)(圖6);在以Der f 3 F和Der f 1 R為引物在酶切10 min、15 min、25 min和30 min的模板中分別擴增出模糊條帶，Der f 3 F和Der f 2 R為引物僅在酶切10 min的模板中分別擴增出清晰條帶，而以Der f 3 F和Der f 3 R為引物分別在酶切15 min、20 min、25 min時出現(xiàn)清晰條帶(圖7)，總體情況如下表(表1)。因此，在Der f 1和Der f 3改組過程中，以Der f 2 F+Der f 2 R為引物可擴增出目的基因;以 Der f 2 F+Der f 3 R、Der f 3 F+Der f 1 R、Der f 3 F+Der f 2 R、Der f 3 F+Der f 3 R為引物也可擴增出少量目的基因，但要受酶切條件的影響。

圖4 Der f 1和Der f 3相同時間酶切產(chǎn)物混合后的無引物PCR電泳結(jié)果1:Der f 1;2 ～6:分別表示10、15、20、25、30 min 酶切時間;7:Der f 3Fig 4 Non-primer results of product mixtures from Der f 1 and Der f 3 at the corresponding time point by DnaseⅠdigestion1:Der f 1;2-6:represent different digested time using DnaseⅠ 10，15，20，25，30 min，respectively;7:Der f 3

圖5 Der f 1 F和 Der f 1 R、Der f 1 F和 Der f 2 R、Der f 1 F和Der f 3 R為引物分別擴增的重組子的PCR結(jié)果Fig 5 PCR results of recombinant fragments using Der f 1 F and Der f 1 R，Der f 1 F and Der f 2 R，Der f 1 F and Der f 3 R，respectively

圖6 Der f 2 F和 Der f 1 R、Der f 2 F和 Der f 2 R、Der f 2 F和Der f 3 R為引物分別擴增的重組子的PCR結(jié)果Fig 6 PCR results of recombinant fragments using Der f 2 F and Der f 1 R，Der f 2 F and Der f 2 R，Der f 2 F and Der f 3 R as primers，respectively

3 討論

過敏性疾病是一種慢性呼吸道炎癥性疾病，其中螨性過敏性哮喘在臨床上尤為常見［1］，粉塵螨變應原Der f 1、Der f 2和Der f 3是誘導哮喘與變態(tài)反應性疾病的最重要變應原之一［9］。變應原特異性免疫治療(allergen special immunotherapy，ASIT)又稱脫敏治療，是目前過敏性疾病的唯一病因治療［3］，但WHO和歐洲變態(tài)反應與臨床免疫學會認為變應原不明確的過敏患者不宜進行特異性免疫治療，且變應原的制備必須標準化［10］。因此，篩選高免疫原性和低變應原性的疫苗，是治療螨性過敏性哮喘的重要手段之一。重組變應原疫苗與天然變應原浸液相比，不僅保留了T細胞的活性表位，同時也降低患者變應原特異性IgE的反應性。近年來，國內(nèi)外研究機構(gòu)應用分子生物學及基因工程已對塵螨變應原進行了克隆［11-14］。本研究根據(jù)GenBank公布的序列設計特異性引物并進行了RT-PCR，結(jié)果表明，已成功克隆出粉塵螨變應原基因Der f 1、Der f 2和 Der f 3。

圖7 Der f 3 F和 Der f 1 R、Der f 3 F和 Der f 2 R、Der f 3 F和Der f 3 R為引物分別擴增的重組子的PCR結(jié)果Fig 7 PCR results of recombinant fragments using Der f 3 F and Der f 1 R，Der f 3 F and Der f 2 R，Der f 3 F and Der f 3 R as primers，respectively

表1 不同引物組合以不同酶切時間后的產(chǎn)物為模板PCR擴增的整體情況Tab 1 Overall results by PCR amplification on the templates based on different digested time through different primers combination

DNA改組技術(shù)是根據(jù)基因同源性的基礎上而進行的體外分子進化技術(shù)，可獲得新基因并可能賦予表達產(chǎn)物以新的功能，從而可用于識別因病原體(包括病毒、細菌和寄生蟲)等為適應生存出現(xiàn)免疫逃避反應而產(chǎn)生的新突變體(抗原或抗體)，提高了宿主的免疫原性［15］。DNA改組條件的優(yōu)化對重組粉塵螨變應原的免疫原性的提高以及變應原性的降低是首要因素［16］。Gafvelin 等［17］對來自不同塵螨的變應原同源基因Lep d 2和Gly d 2(二者的同源性高達接近80%)進行DNA家族改組，篩選后獲得了T細胞反應性不變、但與IgE的結(jié)合能力比野生型低出約80倍的9個理想突變體。本研究對Der f 1和Der f 3的同源性分析表明，二者的同源性達30.38%;采用DnaseⅠ酶切不同的時間后，應用多種引物在不同酶切時間而產(chǎn)生的無引物PCR產(chǎn)物為模板進行擴增后，可產(chǎn)生不同的陽性片段，其大小與Der f 1的PCR產(chǎn)物大小明顯不同，但以Der f 2 F+Der f 2 R為引物可擴增出大小與Der f 3相當?shù)哪康幕颉Ｕf明盡管Der f 1和Der f 3的同源性較低，仍可產(chǎn)生重組片段，打破了傳統(tǒng)的認為只有同源性高(＞80%)的基因才能重組的概念，同時也驗證了不同的酶切時間對基因改組會產(chǎn)生重要影響，從而為后期制備高免疫原性、低變應原性的粉塵螨變應原特異性基因工程重組疫苗以及對疾病的免疫診斷和治療等方面奠定基礎。

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