牛c-Myc/TAT/9R融合表達(dá)載體構(gòu)建及其原核表達(dá)研究

甘 鵬, 熊 亮, 賈文超, 潘傳英,* , 藍(lán)賢勇, 陳 宏

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100; 2. 中山大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275；3. 西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌712100)

原癌基因最早發(fā)現(xiàn)于伯基特淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)患者的腫瘤細(xì)胞中，因其序列類似于骨髓細(xì)胞瘤病毒v-Myc，故被命名為c-Myc[1]。目前，許多研究表明：c-Myc蛋白在乳腺癌、胃癌及白血病等許多腫瘤中都存在異常高表達(dá)[2]；c-Myc不僅是可易位基因，而且還是多種物質(zhì)調(diào)節(jié)的可調(diào)節(jié)基因；此外，c-Myc也是一種可使細(xì)胞無(wú)限增殖且獲得永生化功能、促進(jìn)細(xì)胞分裂的基因[3-5]。2006 年，日本科學(xué)家利用c-Myc和Oct4等4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞在國(guó)際上首次獲得了誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞(iPS)[5]。深入研究發(fā)現(xiàn)，c-Myc等可通過(guò)MAPK 和 GSK3β 途徑協(xié)同降低細(xì)胞死亡，維持干細(xì)胞全能性。由于體細(xì)胞重編程技術(shù)為實(shí)現(xiàn)自體細(xì)胞治療和研究細(xì)胞多能性機(jī)理具有重要科學(xué)價(jià)值[3-4]，為此，c-Myc基因及其表達(dá)在iPS研究中具有重要作用。目前，關(guān)于c-Myc等重要轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)哺乳細(xì)胞重編程研究中，介導(dǎo)外源基因進(jìn)入靶細(xì)胞的方式主要涉及3個(gè)水平：① DNA水平，即病毒介導(dǎo)DNA分子[5]；② RNA水平，即mRNA和miRNA分子重編程[6-7]；③ 蛋白水平：轉(zhuǎn)錄因子蛋白介導(dǎo)[8]。其中，前兩種方式具有低效性、難操作性、高毒性和復(fù)雜性[5-8]，因此，利用轉(zhuǎn)錄因子蛋白直接重編程是獲得iPS細(xì)胞的最佳選擇。蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)域 (Protein transduction domain，PTD) 是一類能夠幫助外源蛋白直接穿透細(xì)胞膜而在細(xì)胞內(nèi)聚集的小陽(yáng)離子肽家族[9]，如來(lái)源于HIV病毒的TAT[10]、11聚精氨酸(poly(11R)[11]和9聚精氨酸(poly(9R))[12-14]等。作為特殊的小分子，它們能夠突破細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層的疏水特性從而穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[10-16]。有研究顯示：利用poly(R)-Oct4、poly(R)-Sox2、poly(R)-Klf4和poly(R)-c-Myc的融合蛋白成功誘導(dǎo)并獲得了小鼠[15]和人[16]的iPS細(xì)胞。這些研究提示，TAT和poly(9R)均可以將與之融合表達(dá)的誘導(dǎo)因子轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入到靶細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)因子蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞重編程。為此，本研究擬構(gòu)建TAT-c-Myc-9R融合蛋白的原核表達(dá)載體，并對(duì)其進(jìn)行表達(dá)分析，利用TAT和poly(9R)的雙重跨膜作用將該蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，為以PTD介導(dǎo)的將該轉(zhuǎn)錄因子等直接重編程體細(xì)胞獲得無(wú)外源基因整合牛iPS研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI、kpnI、xhoI、高保真PrimeSTAR· Max DNA Polymerase購(gòu)自TaKaRa 公司；DNA Marker(DL2000和DL15000)購(gòu)自天根生物公司，蛋白Marker(Protein Ruler II，12kDa-100kDa)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；pGEM-T Easy載體購(gòu)自Promege公司；帶有目的基因的原始質(zhì)粒pMD18-T-bc-Myc由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院呂長(zhǎng)榮博士惠贈(zèng)；表達(dá)的空質(zhì)粒pTAT-HA由第四軍醫(yī)大學(xué)茍興春博士惠贈(zèng)；膠快速回收試劑盒、小量質(zhì)粒抽提試劑盒、大腸桿菌(E.coli)JM109克隆菌株和BL21(DE3)PLyS.S表達(dá)菌株等購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；其他普通試劑如Tris飽和酚和IPTG等，購(gòu)自華美生物工程公司。

1.2 牛c-Myc基因的擴(kuò)增

根據(jù)已發(fā)表的牛c-Myc基因序列(GenBank Accession No.NM_001046074.2)和原核表達(dá)空載體pTAT-HA，設(shè)計(jì)如下引物，由南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司合成：Pro-bc-Myc-F:5'-GGGGTACCATGCCCCTCAACGTCAGCTTCG-3' (斜體加粗并帶下劃線部分表示KpnI 酶切位點(diǎn))，Pro-bc-Myc-R:5'-AAAAAACTCGAGGCGGCGTCTGCGTCTGCGGCGTCTGCGTTAGGCGCAAGAGTTCCG TATCTG-3'(上下游引物上斜體加粗部分分別表示KpnI和XhoI酶切位點(diǎn)，加粗下劃線部分表示9R的編碼序列的反向互補(bǔ)序列)。以pMD18-T-bc-Myc質(zhì)粒為模板，利用以上引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其反應(yīng)體系如下(50 μL)：ddH2O 22 μL，2×PrimeSTAR· Max緩沖液 (Mg2+ conc. (2×) = 2 mM; dNTP Mixture (2×)=0.4 mM each; PrimeSTAR Max DNA Polymerase, TaKaRa, R045A)25 μL，質(zhì)粒DNA 1 μL，上游引物和下游引物各1 μL。根據(jù)高保真聚合酶特殊反應(yīng)說(shuō)明進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，隨后取45 μL PCR產(chǎn)物，與4 μL 的dNTPs(2.5 mM)和1 μLTaqDNA polymerase (5 U/μL)混勻，于PCR儀中72 ℃反應(yīng)1 h，在PCR產(chǎn)物末端添加poly(A)尾巴。

1.3 重組表達(dá)載體pTAT-HA-bc-Myc-9R的構(gòu)建

根據(jù)全式金的DNA快速膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)操作回收bc-Myc-9R片段，并將其與pGEM-T Easy載體按3∶1 的摩爾比在T4 DNA連接酶作用下于4 ℃冰箱連接過(guò)夜，從而構(gòu)建 pGEM-T-bc-Myc-9R重組克隆載體。將4 μL重組載體轉(zhuǎn)化 40 μL感受態(tài)細(xì)胞 JM109，并在含有100 μL IPTG和 20 μL X-gal的氨芐青霉素瓊脂糖平板上進(jìn)行藍(lán)、白斑篩選，然后，挑取部分白色菌落，進(jìn)行PCR鑒定；PCR鑒定為陽(yáng)性的克隆擴(kuò)繁后提取質(zhì)粒DNA(pGEM-T-bc-Myc-9R)，進(jìn)行EcoRI 酶切鑒定；PCR鑒定為陽(yáng)性的克隆接種于含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中200 r/min，37 ℃震蕩培養(yǎng) 12～16 h。用全式金小提質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒DNA，并送南京金斯瑞生物公司測(cè)序。用KpnI 和XhoI酶切測(cè)序正確的克隆載體pGEM-T-bc-Myc-9R獲得帶雙酶切粘性末端的bc-Myc-9R基因片段。酶切體系如下(50 μL)：5 μL 10×M buffer，2 μLKpnI 酶(10 U/μL)，2 μLXhoI(10 U/μL)酶，2 μg 質(zhì)粒，補(bǔ)水至50 μL并混勻后37 ℃孵育4 h。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳后，通過(guò)DNA快速膠回收試劑盒回收。將帶雙酶切位點(diǎn)的目的片段克隆到具有相同酶切位點(diǎn)的pTAT-HA線性化載體上，構(gòu)建重組表達(dá)載體 pTAT-HA-bc-Myc-9R，再利用KpnI 和XhoI酶進(jìn)行雙酶切鑒定。

1.4 重組表達(dá)載體pTAT-HA-bc-Myc-9R的誘導(dǎo)表達(dá)

將陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)pLysS菌株，挑單菌落接種于含100 μg/mL 氨芐青霉素的3～5 mL LB液體培養(yǎng)基中，200～220 r /min，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)；次日，將過(guò)夜培養(yǎng)菌液按1∶100的比例接種到80 mL含有100 μg/mL 氨芐青霉素的 LB液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)使OD600值達(dá)到0.6左右時(shí)，按照 5 mL/管分裝菌液，設(shè)置終濃度分別為0.4，0.6，0.8和1.0 mmol/L 等4個(gè)IPTG濃度和4 h，6 h 和8 h 等3個(gè)時(shí)間梯度，37 ℃，200～220 r/min誘導(dǎo)表達(dá)。收集不同誘導(dǎo)條件下的菌液1.0 mL，10 000 r/min離心5 min；棄上清，沉淀中加入200 μL 1xSDS上樣緩沖液徹底重懸菌體，沸水浴10 min，12 000 r/min離心15 min，取15 μL上清進(jìn)行SDS-PAGE分析[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 pTAT-bc-Myc-9R原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

2.1.1bc-Myc-9R重組片段的獲得 圖1結(jié)果顯示，目的基因bc-Myc-9R的片段大小為1 367 bp，與預(yù)期結(jié)果一致。

2.1.2 pGEM-T-bc-Myc-9R重組載體的菌液PCR鑒定 菌液PCR檢測(cè)結(jié)果(圖2)顯示，所挑選的4個(gè)克隆均擴(kuò)增到了1 367 bp的DNA片段，4個(gè)克隆均為陽(yáng)性。

圖1 bc-Myc-9R重組片段的PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè) 1.PCR擴(kuò)增bc-Myc-9R重組片段；M.DNA marker D2000Fig.1 Detection of PCR product of bc-Myc-9R byagarose gel electrophoresis 1.Amplified fragment of bovine-c-Myc-9R gene by PCR；M.DNA marker D2000

圖2 菌液PCR電泳檢測(cè)1-4.挑選的克隆的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;M.DNA marker D2000Fig.2 Detection of PCR product of bc-Myc-9R frombacteria by agarose gel electrophoresis 1-4.Amplified fragments of different clones；M. DNA marker D2000

2.1.3 pGEM-T-bc-Myc-9R重組質(zhì)粒的EcoRI單酶切鑒定和測(cè)序鑒定 由于在pGEM-T easy 載體上有2個(gè)EcoRI的酶切位點(diǎn)，故pGEM-T-bc-Myc-9R重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRI 單酶切獲得了3 015 bp的pGEM-T片段和1 367 bp的bc-Myc-9R重組DNA片段(圖3)，進(jìn)一步證實(shí)pGEM-T-bc-Myc-9R重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。通過(guò)DNA測(cè)序鑒定，發(fā)現(xiàn)插入pGEM-T easy載體中的bc-Myc-9R的序列完全正確，確認(rèn)pGEM-T-bc-Myc-9R重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.1.4 pTAT-bc-Myc-9R重組質(zhì)粒的酶切鑒定分析 重組質(zhì)粒pTAT-bc-Myc-9R的載體模式圖和酶切鑒定結(jié)果如圖4所示。由圖4b可知， pTAT-bc-Myc-9R原核表達(dá)載體經(jīng)KpnI和XhoI雙酶切后獲得了3 000 bp的pTAT-HA片段和1 367bp的bc-Myc-9R片段，與理論結(jié)果完全相符，證實(shí)原核表達(dá)載體pTAT-bc-Myc-9R構(gòu)建成功。

圖3 pGEM-T-bc-Myc-9R重組質(zhì)粒的EcoRI酶切鑒定1-4.不同克隆質(zhì)粒的EcoRI 的酶切產(chǎn)物；M.DNA marker D15000 Fig.3 EcoRI digestion of the recombinant plasmid ofpGEM-T and bc-Myc-9R gene 1-4.EcoRI digestion of the recombinant plasmid of pGEM-T- bc-Myc-9R from different clonies；M. DNA marker D15000

2.2 pTAT-bc-Myc-9R融合蛋白的原核表達(dá)

原核表達(dá)載體pTAT-bc-Myc-9R轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞BL21(DE3)pLys S后，經(jīng)不同濃度梯度的IPTG誘導(dǎo)后，發(fā)現(xiàn)IPTG的最佳誘導(dǎo)濃度為0.6 mM(終濃度)(結(jié)果未顯示)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未添加IPTG的 pTAT-bc-Myc-9R有少量的泄露表達(dá)。添加IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)菌細(xì)胞比未誘導(dǎo)的細(xì)菌細(xì)胞中目的蛋白的表達(dá)量明顯增加。終濃度0.6 mM的IPTG 37℃誘導(dǎo)4 h和6 h均可很好的表達(dá)融合蛋白(如圖5中紅色箭頭所示)。相同的IPTG的誘導(dǎo)濃度下，誘導(dǎo)6 h的細(xì)胞比誘導(dǎo)4 h的細(xì)胞中目的蛋白的表達(dá)量要大。

3 討 論

哺乳動(dòng)物c-Myc基因是最受科學(xué)家親睞的原癌基因之一，其編碼蛋白在人類基因組中大約有25000個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。c-Myc蛋白的N端能夠影響組蛋白乙?；浮TP酶的作用，而其C端參與調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[17]。1993年，c-Myc缺失的小鼠胚胎不能在妊娠中存活的報(bào)道，引起了科學(xué)家的關(guān)注，也開(kāi)創(chuàng)了c-Myc與干細(xì)胞研究的先河。此后，c-Myc還被證明與細(xì)胞周期的調(diào)控相關(guān)，其通過(guò)若干種途徑推進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，縮短了G1期，從而使細(xì)胞增殖速度加快，細(xì)胞周期縮短，進(jìn)一步提示該基因與ES細(xì)胞或iPS細(xì)胞特性密切相關(guān)[18]。目前，對(duì)體細(xì)胞重編程過(guò)程中，c-Myc的作用有以下兩種主要假設(shè)[19]：① c-Myc和Klf4使終末分化細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤樣轉(zhuǎn)變，因此賦予了體細(xì)胞無(wú)限增殖以及ES細(xì)胞樣的快速生長(zhǎng)能力；② c-Myc可對(duì)體細(xì)胞染色質(zhì)進(jìn)行修飾，使得體細(xì)胞染色體結(jié)構(gòu)變得松散，便于轉(zhuǎn)錄因子與重編程中所需的基因結(jié)合，從而調(diào)控基因表達(dá)。雖然c-Myc基因?qū)PS形成來(lái)說(shuō)并不是必須的，但是，已有資料表明，不使用c-Myc的轉(zhuǎn)錄因子重編程研究中效率相對(duì)很低，而且需要的時(shí)間也更長(zhǎng)一些。目前，關(guān)于牛體細(xì)胞重編研究甚少，為提高牛iPS研究的效率，同時(shí)縮短其周期，本研究進(jìn)行了牛轉(zhuǎn)錄因子c-Myc基因的蛋白表達(dá)研究。

圖4 重組質(zhì)粒pTAT-bc-Myc-9R的酶切鑒定分析a.pTAT-bc-Myc-9R融合表達(dá)載體構(gòu)建的模式；b.pTAT-bc-Myc-9R原核表達(dá)載體的KpnI和XhoI的雙酶切鑒定；1.pTAT-bc-Myc-9R重組質(zhì)粒；2,3.pTAT-bc-Myc-9R KpnI和XhoI的雙酶切產(chǎn)物； M1.DNA marker D15000；M2.DNA marker D2000Fig. 4 Restriction enzyme analysis of pTAT-bc-Myc-9R recombined vectora.Schematic diagram of recombinant pTAT-bc-Myc-9R；b. Aagarose gel electrophoresis of the fragments of pTAT-bc-Myc-9Rdigested by KpnI and XhoI；1. plasmid DNA of pTAT-bc-Myc-9R; 2,3. digestion of pTAT-bc-Myc-9R recombinant plasmid by KpnI and XhoI;M1. DNA marker D15000 ; M2.DNA marker D 2000

圖5 考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)pTAT-bc-Myc-9R的誘導(dǎo)表達(dá)1.0.6 mM IPTG 37 ℃誘導(dǎo)4 h 的結(jié)果；2.pTAT-bc-Myc-9R未誘導(dǎo)的結(jié)果；3.0.6mM IPTG 37 ℃誘導(dǎo)6 h 的結(jié)果；M.ProteinRuler II (12 kDa-100 kDa) Fig. 5 Detection of expression of pTAT-bc-Myc-9Rby Coomassie brilliant blue staining 1.expression of pTAT-b c-Myc -9R induced by 0.6 mMIPTG for 4 h;2. expression of pTAT-b c-Myc -9R withoutIPTG induction for culture 4 h;3.expression of pTAT-b c-Myc -9Rinduced by 0.6 mM IPTG for 6 h; M. Protein Ruler II

由于原癌基因c-Myc的特殊身份，為了避免其對(duì)靶細(xì)胞的整合，故本研究首先表達(dá)c-Myc蛋白，以便于后續(xù)的利用蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子蛋白直接重編程黃牛成纖維細(xì)胞的研究。但是，正常情況下，絕大部分蛋白不能夠穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，而特殊小肽分子PTD(如：TAT和9R) 則既能攜帶核酸也能攜帶蛋白穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)[20-25]。人類iPS的研究中也證明，TAT介導(dǎo)的TAT-轉(zhuǎn)錄因子融合蛋白能夠進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)[25]。2009年，Kim等[26]構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)9R-轉(zhuǎn)錄因子融合蛋白的真核表達(dá)細(xì)胞系(4個(gè)HEK293細(xì)胞系)，并通過(guò)這些細(xì)胞系的細(xì)胞提取物成功誘導(dǎo)了人成纖維細(xì)胞重編程。目前，關(guān)于TAT、11R和9R的研究報(bào)道依然不少。劉雪梅等[10]利用TAT肽獲得TAT-Apoptin 融合蛋白并檢測(cè)到活性；徐麗娟等[11]利用11R獲得人類Oct4和Sox2的融合表達(dá)產(chǎn)物；姜擴(kuò)等[13]利用9R獲得人抗HER2單鏈抗體/精氨酸九聚體融合蛋白；丁道芳等[12]利用9R獲得具有穿透性的人類Sox2融合蛋白；2013年，劉源等[14]發(fā)現(xiàn)9R穿膜肽可增強(qiáng)P53抗腫瘤效果。然而，截止目前，同時(shí)利用TAT和多聚精氨酸(如：9R或8R) 介導(dǎo)牛靶蛋白進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并發(fā)揮功能的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

為此，本研究同時(shí)考慮TAT和9R，進(jìn)行牛c-Myc基因和TAT、9R的融合蛋白表達(dá)研究，從而實(shí)現(xiàn)牛體細(xì)胞重編程。本試驗(yàn)的具體思路如下：直接設(shè)計(jì)只添加有相應(yīng)酶切位點(diǎn)而不含TAT標(biāo)簽的引物，從已有的含有目的基因的質(zhì)粒中擴(kuò)增目的基因，通過(guò)簡(jiǎn)單的酶切，直接連接到多克隆位點(diǎn)上游含有TAT和HA融合表達(dá)標(biāo)簽的pTAT-HA質(zhì)粒，減少了多次擴(kuò)增可能導(dǎo)致基因突變的概率。此外，在c-Myc的C端和N端分別添加了均有跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的TAT和9R。通過(guò)一系列的分子生物學(xué)和基因工程操作，成功克隆得到了重組質(zhì)粒pTAT-bc-Myc-9R，通過(guò)對(duì)IPTG的誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時(shí)間等誘導(dǎo)條件的優(yōu)化，確定了最佳的誘導(dǎo)條件為終濃度0.6 mmol/L的IPTG 37 ℃誘導(dǎo)6 h。雖然未添加IPTG的 pTAT-bc-Myc-9R有少量的泄露表達(dá)，可能跟培養(yǎng)基中殘存有少量的乳糖(最后轉(zhuǎn)化成半乳糖而誘導(dǎo)目的蛋白少量的表達(dá))有關(guān)，此現(xiàn)象跟梁英民等[26]的研究報(bào)道一致。但是從BL21(DE3)pLys S自身的背景條帶對(duì)比可以看出，添加IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)菌比未誘導(dǎo)的細(xì)菌中目的蛋白的量明顯增加。此外，由于TAT-bc-Myc-9R融合蛋白中含有6個(gè)His標(biāo)簽蛋白和9個(gè)精氨酸，這些堿性氨基酸導(dǎo)致此融合蛋白在SDS-PAGE中遷移變慢，從而出現(xiàn)分子量偏大的現(xiàn)象；這與唐威華等[27]的研究結(jié)果相似。這些研究結(jié)果可為后續(xù)利用TAT-轉(zhuǎn)錄因子融合蛋白直接誘導(dǎo)獲得黃牛iPS細(xì)胞奠定了基礎(chǔ)。

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