紫外線法對壓載水中淡水藻的滅活效果

劉 澈

（1．清華大學 環(huán)境學院，北京100084；2．中國電子工程設(shè)計院，北京100840）

紫外線技術(shù)用于滅活藻類開始于20世紀90年代．1993 年研究者將紫外線用于滅活二角多甲藻［1－2］，隨后又 用 于 卡 盾 藻［3］．我國學者也 陸 續(xù) 研 究了紫外線對銅綠微囊藻［4］、念珠藻［5］、水廠源水中的淡水藻類［6］的滅活效果，報道了紫外線輻照光催化TiO2氧化法滅活魚腥藻［7］、H2O2與紫外線聯(lián)合滅活魚腥藻的效果［8］．2001年，國際上首次報道了紫外線對銅綠微囊藻的生長抑制效果［9］．2007年，Sakai等人研究了紫外線對銅綠微囊藻、多變魚腥藻的生長抑制效果［10］和對微囊藻毒素釋放的影響［11］，建立數(shù)學模型，并進一步分析了紫外線對微囊藻毒素釋放的影響［12］．

壓載水生物入侵是海洋的四大危害之一［13］，國際海事組織環(huán)境保護委員會專門成立了壓載水工作組并制定了《船舶壓載水和沉積物控制和管理國際公約》，規(guī)定了嚴格的D－2 排放標準，該草案于2012年開始強制執(zhí)行．由于紫外線輻射對微生物滅活的高效，不產(chǎn)生消毒副產(chǎn)物，國際上多采用過濾和紫外線輻射的組合工藝處理壓載水．國內(nèi)外對紫外線處理壓載水中藻類滅活效果的研究報道比較少．本文依照《公約》對岸基測試試驗的要求，采用準平行光束儀對8種常見的淡水藻進行紫外線輻射，黑暗環(huán)境培養(yǎng)5d，確定劑量反應(yīng)關(guān)系，研究紫外線對它們的滅活效果及特點．

1 材料與方法

1．1 藻種及來源

試驗選用4個門的8種淡水藻．硅藻門：梅尼小環(huán)藻（CyclotellameneghinianaKutz，中科院淡水藻種庫（FACHB）編號為739）、谷皮菱形藻（Nitzschia palea．，F(xiàn)ACHB 編 號 為 209）和鈍脆桿藻（Fragilariacapucina，F(xiàn)ACHB編號為1062）．綠藻門：小 球 衣 藻（Chlamydomonasmicrosphaera，F(xiàn)ACHB編號為54）、鐮形纖維藻（Ankistrodesmus falcatus，F(xiàn)ACHB 編號為18）和斜生柵藻（Scenedesmusobliquus，F(xiàn)ACHB編號為417）．藍藻門：銅綠微囊藻（Microcystissp．，F(xiàn)ACHB 編號為1018）．隱藻門：卵形隱藻（CryptomonasovataHer，F(xiàn)ACHB編號為472）．藻種由中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會淡水藻種庫提供．

1．2 培養(yǎng)方法和條件

藻種培養(yǎng)液采用蒸餾水配制．不同藻種的培養(yǎng)液采用配方如下：梅尼小環(huán)藻119，谷皮菱形藻和鈍脆桿藻D1，小球衣藻、鐮形纖維藻和斜生柵藻SE，銅綠微囊藻BG11，卵形隱藻WC．培養(yǎng)液的配制、藻液的接種和培養(yǎng)均是在無菌條件下進行．為了保證藻液的純度，每天用顯微鏡觀察1次．

藻液置于人工氣候箱三角瓶內(nèi)培養(yǎng)，光照和光暗培養(yǎng)溫度（22±0．5）°C，光照強度2 500lx，光暗周期14h∶10h．培養(yǎng)過程中每天用手搖動藻液6次．

藻液經(jīng)紫外線輻射后，靜置于生物培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度（22±0．5）°C．

藻種在指數(shù)生長期接種．選擇生長良好的處于穩(wěn)定生長期的藻液進行試驗．試驗時藻液濃度約為107～108個·L－1．

1．3 試驗裝置

試驗所采用的準平行光束儀（北京安利斯科技發(fā)展有限公司）是按照國際紫外線協(xié)會的標準設(shè)計．選用低壓汞燈作為光源，紫外線燈管安裝在一個封閉的圓柱體內(nèi)，在筒體的底部中央開口，下方接一段長度可以調(diào)節(jié)的內(nèi)徑為9．3cm 的圓管，使紫外線能夠垂直到達樣品的表面［14］．紫外線燈管的功率為105 W，其中輸出254nm 波長紫外線的功率為35 W，通過改變筒體的長度，調(diào)節(jié)到達微生物的不同紫外線強度．

1．4 紫外線輻射處理

取15mL藻液，倒入Φ70mm 培養(yǎng)皿中，置于電磁攪拌器上攪拌，分別經(jīng)準平行光束儀100，200，300和400mJ·cm－2的紫外線劑量輻射后立即倒入棕色瓶中，靜置于生物培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)．試驗采用紫外線強度為0．5～0．6mW·cm－2．紫外線強度用UVB型紫外線輻照計（北京師范大學科學儀器廠）測定．

紫外線劑量計算公式為

式中：D為紫外線劑量，mJ·cm－2；I為平均紫外線強度，mW·cm－2，根據(jù)國際紫外線協(xié)會提供的計算表格計算；t為輻射時間，s．

1．5 藻細胞滅活率計算

紫外線輻射藻液后黑暗環(huán)境培養(yǎng)5d，取1mL，用Lugol碘液固定，顯微鏡下血球計數(shù)板計數(shù)并計算藻細胞密度．每個樣品計數(shù)3次．以未經(jīng)紫外線輻射的藻液作為空白對照樣，置于生物培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)．

經(jīng)紫外線輻射后的藻細胞會變形、破裂、內(nèi)容物溢出，試驗中無細胞壁或無內(nèi)容物的藻細胞被認為是滅活．藻細胞滅活率計算公式為

式中：Nb為輻射前藻細胞個數(shù)；Na為輻射后黑暗培養(yǎng)5d的藻細胞個數(shù)．

黑暗時藻細胞不能進行光合作用，會影響藻細胞的生長，黑暗對藻細胞的抑制率計算公式為

式中：Nd0為黑暗培養(yǎng)前藻細胞個數(shù)；Nd為黑暗培養(yǎng)5d后藻細胞個數(shù)．

2 結(jié)果和討論

2．1 紫外線法對3種硅藻的滅活效果

由圖1可以看出，紫外線法對3 種硅藻的滅活效果表現(xiàn)出顯著的差異性．

梅尼小環(huán)藻在黑暗環(huán)境培養(yǎng)5d后藻細胞數(shù)量減少了38．8%，黑暗對藻細胞有一定的抑制作用，藻細胞需要光合作用才能生長，失去光合作用有一些藻細胞死亡．梅尼小環(huán)藻經(jīng)紫外線輻射黑暗環(huán)境培養(yǎng)5d后，藻細胞全部沉積在血球計數(shù)板上，隨著紫外線劑量的增加，藻細胞的內(nèi)容物中出現(xiàn)了更多深褐色的凝塊，細胞內(nèi)容物不完整的數(shù)量也增多，更多的藻細胞內(nèi)容物已經(jīng)完全消失只剩下細胞壁．梅尼小環(huán)藻對紫外線和黑暗環(huán)境的共同作用比較敏感，滅活率隨著劑量的增加而快速提高，在劑量為100 mJ·cm－2時的滅活率為48．1%．隨著劑量繼續(xù)增加，藻細胞對劑量的變化不再敏感，滅活率增加非常緩慢，在劑量為200，300和400mJ·cm－2時的滅活率分別為50．4%，51．4%和54．3%．紫外線法對梅尼小環(huán)藻具有較好的滅活效果．

圖1 紫外線法對3種硅藻的滅活效果Fig．1 The inactivation effect of UC－V on three species of Bacillariophyta

鈍脆桿藻在黑暗環(huán)境培養(yǎng)5d后藻細胞數(shù)量增加了32．5%，藻細胞對黑暗表現(xiàn)出很強的忍耐能力，失去光合作用仍有一些藻細胞能生長繁殖．鈍脆桿藻經(jīng)紫外線輻射黑暗環(huán)境培養(yǎng)5d后，有少量的藻細胞沉積在血球計數(shù)板底部，有的藻細胞內(nèi)容物中出現(xiàn)了深綠色的凝塊．小劑量的紫外線輻射會刺激鈍脆桿藻細胞生長，藻細胞數(shù)量隨著劑量的增加而增多．在紫外線輻射和黑暗環(huán)境的共同作用下，藻細胞數(shù)量明顯增多，在劑量為100和200 mJ·cm－2時，藻細胞數(shù)量分別增加34．5%和39．4%．在劑量大于200mJ·cm－2時，藻細胞數(shù)量隨著劑量的增加開始減少，紫外線對藻細胞的生長促進作用開始減弱，在劑量為300和400 mJ·cm－2時藻細胞數(shù)量分別增加29．8%和16．8%．在劑量小于400 mJ·cm－2時紫外線法對鈍脆桿藻沒有滅活效果．

黑暗環(huán)境培養(yǎng)5d后谷皮菱形藻細胞數(shù)量減少了10%，黑暗對藻細胞的生長有抑制作用，藻細胞需要光合作用才能生長，失去光合作用5d有少量藻細胞死亡．谷皮菱形藻經(jīng)紫外線輻射黑暗環(huán)境培養(yǎng)5d后，大多數(shù)的藻細胞沉積在血球計數(shù)板底部，有的藻細胞內(nèi)容物不完整，有的藻細胞只剩下細胞壁．谷皮菱形藻對紫外線輻射敏感，滅活率隨著劑量的增加而提高，在劑量為100 mJ·cm－2時的滅活率為23．7%．隨著劑量繼續(xù)增加，藻細胞對劑量的變化不再敏感，滅活率增加緩慢，在劑量為200，300和400 mJ·cm－2時的滅活率分別為26．8%，32．2%和36．9%．紫外線法對谷皮菱形藻具有一定的滅活效果．

2．2 紫外線法對3種綠藻的滅活效果

由圖2可以看出，紫外線法對3 種綠藻的滅活效果表現(xiàn)出巨大的差異性．

圖2 紫外線法對3種綠藻的滅活效果Fig．2 The inactivation effect of UC－V on three species of Chlorophyta

鐮形纖維藻在黑暗環(huán)境培養(yǎng)5d后藻細胞數(shù)量增加了20．9%，藻細胞對黑暗表現(xiàn)出一定的忍耐能力，失去光合作用5d有一些藻細胞能生長繁殖．經(jīng)紫外線輻射黑暗環(huán)境培養(yǎng)5d后，鐮形纖維藻有半數(shù)藻細胞沉積在血球計數(shù)板底部，細胞內(nèi)容物中出現(xiàn)了深綠色的凝塊．藻細胞對紫外線比較敏感，藻細胞數(shù)量隨著劑量的增加而快速減少．由于鐮形纖維藻在黑暗時生長繁殖的數(shù)量多于紫外線對藻細胞滅活而減少的數(shù)量，因此在紫外線輻射黑暗環(huán)境培養(yǎng)5d后藻細胞的數(shù)量仍然增加了，在劑量為100 mJ·cm－2時，藻細胞數(shù)量增加了2．2%．隨著劑量繼續(xù)增加，對藻細胞的生長促進作用減弱，藻細胞數(shù)量開始減少，在劑量為200mJ·cm－2時細胞數(shù)量比對照樣增加0．7%．小劑量時紫外線法對鐮形纖維藻沒有滅活效果．在劑量大于300mJ·cm－2時對藻細胞有滅活效果，滅活率隨著劑量的增加開始快速提高，在劑量為300和400mJ·cm－2時的滅活率分別為1．2%和29．5%．

黑暗環(huán)境培養(yǎng)5d后斜生柵藻細胞數(shù)量增加了3．7%，藻細胞對黑暗表現(xiàn)出一定的忍耐能力，失去光合作用仍有少量藻細胞能生長繁殖．斜生柵藻經(jīng)紫外線輻射黑暗環(huán)境培養(yǎng)5d后，有少量藻細胞沉積在血球計數(shù)板底部，細胞顏色變暗，細胞群體不再排成一列，全部分散開．斜生柵藻對紫外線輻射非常不敏感，具有較強的抗性，隨著劑量的增加，藻細胞數(shù)量減少得非常緩慢．由于在黑暗時生長繁殖的藻細胞數(shù)量多于紫外線對藻細胞滅活而減少的數(shù)量，因此在紫外線輻射黑暗環(huán)境培養(yǎng)5d后藻細胞的數(shù)量仍然增加了，在劑量為100和200mJ·cm－2時藻細胞數(shù)量分別增加0．7%和0．4%．劑量增加到300mJ·cm－2時，對藻細胞有滅活效果，在劑量為300和400 mJ·cm－2時的滅活率分別為0．3%和3．2%．

黑暗環(huán)境培養(yǎng)5d后小球衣藻細胞數(shù)量減少了53．5%，黑暗對藻細胞生長有很強的抑制作用，藻細胞需要光合作用才能生長，失去光合作用5d有半數(shù)藻細胞死亡．小球衣藻經(jīng)紫外線輻射黑暗培養(yǎng)5d后，藻細胞全部沉積在血球計數(shù)板底部，細胞顏色變成淺綠色，隨著劑量的增加，藻細胞變型更嚴重，有更多細胞的內(nèi)容物溢出．小劑量的紫外線會刺激小球衣藻細胞生長，對藻細胞生長有促進作用，藻細胞數(shù)量隨劑量的增加而增多．由于黑暗對小球衣藻細胞生長的抑制作用遠大于紫外線輻射對藻細胞生長的促進作用，因此藻細胞在5d后的數(shù)量還是顯著減少，在劑量為100和200mJ·cm－2時對藻細胞的滅活率分別為53．0%和49．3%．在劑量大于200mJ·cm－2時，藻細胞的數(shù)量開始緩慢減少，對藻細胞生長的促進作用開始減弱．在劑量為300 和400 mJ·cm－2時的滅活率分別為57．1%和59．7%．紫外線法對小球衣藻有較好的滅活效果．

2．3 紫外線法對銅綠微囊藻和卵形隱藻的滅活效果

如圖3所示，銅綠微囊藻在黑暗環(huán)境培養(yǎng)5d后藻細胞數(shù)量減少了21．8%，黑暗對藻細胞生長有一定的抑制作用，失去光合作用有一些藻細胞死亡．經(jīng)紫外線輻射黑暗環(huán)境培養(yǎng)5d后，藻細胞全部沉積在血球計數(shù)板底部．銅綠微囊藻對紫外線輻射和黑暗的共同作用十分敏感，滅活率隨著劑量的增加而快速提高，在劑量為100和200mJ·cm－2時的滅活率分別為52．3%和73．4%．隨著劑量繼續(xù)增加，藻細胞對劑量變化不再敏感，滅活率增加緩慢，在劑量為300和400 mJ·cm－2的滅活率分別為77．3%和86．1%．紫外線法對銅綠微囊藻具有較好的滅活效果．

在黑暗環(huán)境培養(yǎng)5d后卵形隱藻細胞數(shù)量增加了28．4%，藻細胞對黑暗表現(xiàn)出很強的忍耐能力，失去光合作用5d仍有一些藻細胞能生長繁殖．卵形隱藻經(jīng)紫外線輻射再黑暗培養(yǎng)5d后，只有少量的藻細胞沉積在血球計數(shù)板底部．卵形隱藻對紫外線輻射很不敏感，具有一定的抗性，隨著劑量的增加，藻細胞數(shù)量減少緩慢．由于藻細胞在黑暗時生長繁殖的藻細胞數(shù)量遠遠多于紫外線對藻細胞滅活而減少的數(shù)量，因此在紫外線輻射黑暗環(huán)境培養(yǎng)5d后藻細胞的數(shù)量仍然增加了，在劑量為100，200，300 和400 mJ·cm－2時，藻細胞數(shù)量分別增加22．8%，18．5%，11．5%和8．6%（圖3）．在劑量小于400 mJ·cm－2時紫外線法對卵形隱藻沒有滅活效果．

圖3 紫外線法對銅綠微囊藻和卵形隱藻的滅活效果Fig．3 The inactivation effect of UC－V on Microcystis sp．a(chǎn)nd Cryptomonas ovata Her

2．4 作用效果分析

水體中的藻細胞會處于一個接受陽光適宜、對自身生長有利的深度．試驗顯示，經(jīng)紫外線輻射黑暗環(huán)境培養(yǎng)5d后的藻細胞更易于沉降于血球計數(shù)板底部，并且隨著紫外線劑量的增加沉降的藻細胞數(shù)量更多．這可能是由于藻細胞經(jīng)紫外線照射后產(chǎn)生了自由基和活性氧［15－16］，同時藻細胞的氣囊結(jié)構(gòu)受到了破壞，從而影響了藻細胞的懸浮功能．

有研究者認為個體較小而具有較大表面積與體積比的藻細胞耐受紫外線輻射的能力更強［17］，而Xiong等試驗研究認為，藻細胞的大小可能改變紫外線篩選作用的有效性，但細胞個體大小與敏感性之間并沒有一致性關(guān)系［18］．本試驗8種淡水藻中鐮形纖維藻和鈍脆桿藻的個體大小相差不多，紫外線對鐮形纖維藻的滅活率比較高，對青島大扁藻的滅活率比較低．因此，從試驗結(jié)果可以說明藻細胞個體大小可能不是影響紫外線滅活效果的原因．

從低等生物到高等生物的許多研究表明，生物體在受到輻射和化學藥物的低劑量處理后往往表現(xiàn)出促進作用，這可能是由于生物的抗逆性起作用刺激生長．Stebbing把毒物在低濃度下出現(xiàn)這種增益現(xiàn)象是其在無毒情況下的刺激反應(yīng)稱為“毒物的興奮效應(yīng)”［19］．紫外線UV－B輻射能促進微藻生長的現(xiàn)象在其它的 試驗中 有 報 道［20－21］，但UV－C 輻射能促進藻細胞生長的現(xiàn)象未見報道．本試驗中小劑量的紫外線輻射能刺激鈍脆桿藻和小球衣藻細胞生長，隨著劑量增加藻細胞的數(shù)量也增多，當劑量大于300 mJ·cm－2時，藻細胞的數(shù)量開始緩慢減少，對藻細胞的生長促進作用開始減弱，并且隨著劑量的增加，減弱的幅度也增大．

大多數(shù)藻類是專性光合自養(yǎng)生物，以光作為能量，還原CO2為碳水化合物而獲得生物量．紫外線輻射能抑制藻細胞生長，引起葉綠素降解和光合速率下降，并進一步證實這些傷害是由于藻細胞內(nèi)產(chǎn)生有傷害作用的活性氧（超氧陰離子自由基和過氧化氫）所致［22］．本實驗中鈍脆桿藻和小球衣藻受到紫外線輻射，隨著劑量的增加，首先表現(xiàn)出對藻細胞生長的促進作用，隨著劑量的進一步增加，促進作用逐漸減弱．可能是因為小劑量紫外線輻射刺激使藻細胞內(nèi)的活性氧含量增加，而清除活性氧的抗氧化系統(tǒng)也被紫外線誘導增強，所以抗氧化能力增強，藻細胞生長加快；但隨著紫外線劑量的增加，活性氧在細胞體內(nèi)大量積累，抗氧化系統(tǒng)不足以清除過量的活性氧，所以抗氧化能力下降，細胞受到氧化傷害，細胞分裂速度下降，并且隨劑量的增加促進作用減弱；隨著劑量的進一步增加，紫外線輻射開始對藻細胞產(chǎn)生了滅活作用．有的研究認為紫外線吸收化合物如MAAs（mycosporine amino acid）、黃酮醇及多胺類化合物在保護水生生物免受紫外線輻射傷害起重要的作用［23］，有試驗報道生物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)，如抗氧化酶系統(tǒng)成分SOD，POD，GPX 和非酶系統(tǒng)成分如抗壞血酸、β胡蘿卜素、GSH 等在保護細胞免受輻射方面具有重要意義［24］，也有文獻報道，紫外線輻射使藻細胞分泌大量多糖作為親水性基質(zhì)，將紫外線吸收色素包裹在基質(zhì)中，既幫助紫外線吸收色素固定在細胞壁外，又延長了紫外線進入細胞壁的通道，部分多糖直接和紫外線色素連接成為新型紫外線吸收活性物質(zhì)［25］．小劑量的紫外線輻射能夠刺激鈍脆桿藻和小球衣藻生長，藻細胞的紫外線吸收化合物與抗氧化系統(tǒng)的保護機制的特殊性可能是根本原因，應(yīng)從生理生化指標對它們做進一步研究．

從紫外線對梅尼小環(huán)藻、谷皮菱形藻、小球衣藻、鐮形纖維藻、斜生柵藻和銅綠微囊藻的滅活效果圖中的曲線趨勢可以得出，當紫外線劑量超過400 mJ·cm－2時，隨著紫外線劑量的增加，對這幾種藻的滅活效果可能會進一步提高．當紫外線劑量超過400mJ·cm－2的某一值時，可能會刺激鈍脆桿藻和卵形隱藻細胞的生長，也可能對藻細胞產(chǎn)生滅活作用．可以增加紫外線劑量做進一步的試驗研究．

從試驗結(jié)果中可以看出，紫外線輻射對淡水藻的滅活效果較差，當采用過濾和紫外線的組合工藝處理壓載水時，不能依靠紫外線工藝去除藻類．紫外線和高級氧化技術(shù)（AOT）聯(lián)用、紫外線和超聲波聯(lián)用、中壓紫外線可能將會成為壓載水處理技術(shù)的研究熱點之一．

3 結(jié)論

（1）紫外線輻射對梅尼小環(huán)藻、谷皮菱形藻、小球衣藻和銅綠微囊藻具有一定的滅活效果，滅活率隨著紫外線劑量的增加而提高．

（2）小劑量的紫外線會刺激鐮形纖維藻和斜生柵藻細胞生長，藻細胞數(shù)量隨劑量的增加而增多，在劑量大于300mJ·cm－2時，藻細胞的數(shù)量開始緩慢減少．

（3）紫外線劑量小于400mJ·cm－2時紫外線法對鈍脆桿藻和卵形隱藻沒有滅活效果．

（4）紫外線輻射對淡水藻的滅活效果較差．

（5）藻細胞個體大小不是影響紫外線滅活效果的原因，藻的種類、藻細胞壁的有無及其成分的不同可能是造成不同滅活效果的原因．

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