系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血Th1細(xì)胞自噬相關(guān)標(biāo)記物的表達(dá)①

王 超 潘慶軍 馮永民 劉偉敬 劉華鋒

(廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎臟疾病研究所，湛江524001)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)是以免疫調(diào)節(jié)失衡為特征的一種自身免疫性疾病，已有大量的研究證實，輔助性T細(xì)胞(Th細(xì)胞)功能失常在SLE發(fā)生發(fā)展中起極其重要的作用，其中Th1細(xì)胞因子功能亢進(jìn)導(dǎo)致大量的Th1細(xì)胞因子分泌并參與了SLE的發(fā)?。?-3］。因此，深入研究SLE患者Th1細(xì)胞功能變化，對進(jìn)一步明確Th1細(xì)胞在SLE發(fā)病中的作用至關(guān)重要。

自噬(Autophagy)是一種廣泛存在于真核生物的生命現(xiàn)象，細(xì)胞通過自噬降解自身衰老或損傷的細(xì)胞器和其他大分子物質(zhì)，與細(xì)胞的生長、分化、功能和存活密切相關(guān)。近期陸續(xù)有學(xué)者研究SLE患者免疫細(xì)胞自噬是否存在異常，趙繼軍［4］和Frédéric［5］等人發(fā)現(xiàn) SLE 患者外周血單個核細(xì)胞(PBMC)自噬泡堆積。但PBMC細(xì)胞種類繁多，作為在SLE發(fā)病中起重要作用的Th1細(xì)胞，其自噬情況如何?尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報道。本研究通過檢測SLE患者外周血Th1細(xì)胞自噬通路幾種關(guān)鍵標(biāo)記物Phospho-mTOR、Beclin-1、LC3和 p62的表達(dá)情況，借此探討SLE患者Th1細(xì)胞自噬活性，進(jìn)而初步探討自噬異常在SLE發(fā)病過程中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2011年11月至2012年12月廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎病內(nèi)科住院SLE患者68例(男13例，女55例)，診斷均符合1997年美國風(fēng)濕病協(xié)會(ACR)修正的SLE分類標(biāo)準(zhǔn)。收集SLE患者的臨床資料及實驗室檢查數(shù)據(jù)，并計算患者SLE 活動指數(shù)(SLE disease activity index，SLEDAI)，根據(jù)SLEDAI評分將SLE患者分為活動組(SLEDAI≥10分)46例(包括初診活動期31例和復(fù)發(fā)活動期15例)和非活動組(SLEDAI＜10分)22例?；顒咏M患者平均年齡為(24.3±7.2)歲，非活動組患者平均年齡為(30.1±9.2)歲，對照組為健康志愿者23例(男5例，女18例)，平均年齡(23.7±5.3)歲，三組之間性別、年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

1.2 試劑和儀器 PE-anti human IFN-γ、PE-Cy7-anti human CD3、APC-Cy7-anti human CD4 及其同型對照均購自BioLegend公司，anti human Beclin-1及其同型對照購自Abcam公司，anti human PhosphomTOR及其同型對照均購自Cell Signaling Technology公司，anti human LC3抗體及其同型對照購自MBL公司，anti human p62及其同型對照購自BD biosciences公司，F(xiàn)ITC-anti mouse/rabbit IgG購自Santa cruz公司。裂解液、固定液、穿透液和染色液購自BioLegend和ebioscience公司。流式細(xì)胞儀為BD FACSCantoTMII。

1.3 外周血Th1細(xì)胞自噬標(biāo)記物測定

1.3.1 免疫熒光標(biāo)記 采集受試者清晨空腹外周靜脈血3 ml，EDTA充分抗凝;取18支試管用于制備樣本，先將裂解液分別加入上述各試管當(dāng)中，每管3 ml，再將新鮮外周血標(biāo)本150 μl分別加入上述試管當(dāng)中充分裂解;離心后去上清，加入10 mmol/L PBS洗滌，加入固定液充分固定細(xì)胞;繼之加入穿透液2 ml/管，洗滌穿透2次，1 500 r/min ×6分鐘/次。加入穿透液100 μl/管重懸細(xì)胞后加羊血清封閉;在試管1～10 加入 0.3 μl的 PBS，11 ～14 分別加入 Beclin-1、Phospho-mTOR、LC3、p62 抗體的同型對照(量與加入相應(yīng)抗體的量相同)，試管15加入Beclin-1抗體 0.3 μl，試管 16 加入 Phospho-mTOR抗體1 μl，試管17 加入 LC3 抗體0.3 μl，試管18 加入p62抗體0.3 μl，充分振蕩混勻，室溫避光孵育30分鐘;加入PBS洗滌2次;加入穿透液100 μl/管重懸細(xì)胞后，加入相應(yīng)適量二抗，避光孵育30分鐘;再次洗滌2次;加入染色液100 μl/管重懸細(xì)胞，試管1未加入任何抗體，為調(diào)節(jié)各熒光通道的電壓用，試管2～8加入單色抗體為調(diào)制熒光補(bǔ)償用，試管9加入抗體 CD3-PE-Cy7 10 μl、CD4-APC-CY7 10 μl、Mouse IgG1，κ-PE 10 μl，試管 10 ～18 均加入抗體CD3-PE-Cy7 10 μl、CD4-APC-CY7 10 μl、IFN-γ-PE 10 μl，振蕩搖勻上述各試管，避光孵育30分鐘;洗滌2次后加入200 μl染色液重懸細(xì)胞;移液至流式管中，流式上機(jī)檢測分析。

1.3.2 流式細(xì)胞儀檢測 設(shè)置相應(yīng)各通道電壓和通道之間熒光補(bǔ)償后，根據(jù)前向散射角和側(cè)向散射角，對整個白細(xì)胞進(jìn)行設(shè)門，以CD3+CD4+IFN-γ+定義為 Th1細(xì)胞［6］。測定 Th1細(xì)胞的 Beclin-1、Phospho-mTOR、LC3、p62的表達(dá)水平，以平均熒光強(qiáng)度(Mean fluorescence intensity，MFI)表示。

1.4 SLE的其他指標(biāo)檢測方法 補(bǔ)體C3采用免疫速率散射比濁法，anti-dsDNA采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。根據(jù)Kolmogorov-Smimov正態(tài)性檢驗可知該組資料為偏態(tài)分布，本文采用非參數(shù)檢測的方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計數(shù)資料差異比較采用χ2檢驗，計量資料采用中位數(shù)(四分位間距)［M(P25-P75)］表示，Mann-Whitney Test分析;非參數(shù)數(shù)據(jù)的相關(guān)分析采用Spearman秩相關(guān)，分別比較自噬相關(guān)標(biāo)記物與SLEDAI評分及免疫學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性。以健康自愿者外周血Th1細(xì)胞Phospho-mTOR的第95百分位數(shù)和第5百分位數(shù)測量數(shù)據(jù)的上限和下限為參考值范圍。敏感度=SLE活動時該指標(biāo)的陽性人數(shù)/實際SLE活動人數(shù);診斷SLE是否活動的特異度=SLE非活動時該指標(biāo)的陰性人數(shù)/實際SLE非活動人數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 各組Th1細(xì)胞自噬相關(guān)標(biāo)記物的比較 SLE活動組和非活動組外周血Th1細(xì)胞Phospho-mTOR的平均熒光強(qiáng)度分別為1 366(1 099，1 579.2)，1 953.5(1 868.5，2 151.5)］低于對照組 2 247(2 072，2 488)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均 P＜0.05);SLE活動組外周血Th1細(xì)胞Phospho-mTOR的平均熒光強(qiáng)度低于非活動組(P＜0.05)，見圖1A。

SLE活動組和非活動組的外周血Th1細(xì)胞Beclin-1 的平均熒光強(qiáng)度分別為［494(392.75，586.5)，529(396，566.5)］，低于對照組 655.5(522，973.5)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。但SLE活動組與非活動組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見圖1B。

圖1 各組Th1細(xì)胞自噬相關(guān)標(biāo)記物的表達(dá)情況Fig.1 The expression of autophagy markers of Th1 cells from both SLE patients and health control

SLE活動組的外周血Th1細(xì)胞LC3的平均熒光強(qiáng)度為 383.5(314，409)，高于非活動組 240(211.25，333.75)和對照組 254(221，299)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而非活動組與健康對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見圖1C。

SLE活動組和非活動組的外周血Th1細(xì)胞p62的平均熒光強(qiáng)度［分別為 172(156，181)，168.5(154.75，188.25)］與對照組 169.25(156.25，179.75)相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見圖1D。

2.2 SLE患者Th1細(xì)胞自噬相關(guān)標(biāo)記物與補(bǔ)體C3、SLEDAI評分和Anti-dsDNA的相關(guān)性 SLE患者組外周血Th1細(xì)胞自噬相關(guān)標(biāo)記物PhosphomTOR的平均熒光強(qiáng)度與血清C3水平呈正相關(guān)(rs=0.458，P ＜ 0.05)，與 SLEDAI評分呈負(fù)相關(guān)(rs= －0.829，P ＜0.01)，與血清 anti-dsDNA 水平呈負(fù)相關(guān)(rs= －0.637，P ＜0.01)。而 SLE 患者組外周血Th1細(xì)胞其他自噬相關(guān)指標(biāo)與血清C3水平、SLEDAI評分、血清anti-dsDNA水平均無相關(guān)關(guān)系(表1)。

2.3 SLE患者外周血Th1細(xì)胞自噬相關(guān)標(biāo)記物與SLE活動度 正常人外周血Th1細(xì)胞PhosphomTOR的 MFI的中位數(shù)為 2 247，95%位數(shù)為2 791.2，5%位數(shù)為1 899.4。因此SLE患者外周血Th1細(xì)胞Phospho-mTOR的MFI低于1 899.4即為疾病活動性陽性;補(bǔ)體C3＜0.70 g/L為疾病活動性陽性;血清Anti-dsDNA水平以醫(yī)院檢驗科定性指標(biāo)(陽性/陰性)為準(zhǔn)。如表2所示，在判斷SLE是否活動時，SLE患者組外周血Th1細(xì)胞自噬相關(guān)標(biāo)記物(Phospho-mTOR)和補(bǔ)體C3的敏感性顯著高于血清Anti-dsDNA，但特異性相對較差。

表1 SLE患者Th1細(xì)胞自噬相關(guān)標(biāo)記物與補(bǔ)體C3、SLEDAI評分和Anti-dsDNA的相關(guān)分析Tab.1 Correlation between the expressions of autophagy markers of Th1 cells with anti-dsDNA，C3 and SLEDAI scores

表2 Phospho-mTOR、C3和 Anti-dsDNA的變化評判SLE活動度的比較Tab.2 Comparition of changes of Phospho-mTOR，C3 and anti-dsDNA for activity of SLE

3 討論

自噬(Autophagy)是胞漿大分子物質(zhì)和衰老細(xì)胞器在膜包囊泡中降解的生物學(xué)過程，其主要功能是確保細(xì)胞在受到應(yīng)激性死亡威脅時可以保持存活。目前認(rèn)為自噬是一個動態(tài)連續(xù)的過程，包含自噬體的形成，自噬性底物向溶酶體的運(yùn)送和在溶酶體內(nèi)降解的整個過程［7］。首先，在自噬誘因(例如饑餓和氧化應(yīng)激等)作用下，mTOR(mammalian target of rapamycin)磷酸化受抑制，對自噬通路啟動抑制減弱，同時自噬調(diào)節(jié)蛋白Beclin-1表達(dá)升高，自噬啟動;繼之，ULK1復(fù)合物和PI3k(classⅢ PtdIns 3-kinase)復(fù)合物定位于 phagophore［8］，并隨著 LC3(微管相關(guān)蛋白輕鏈3)和其他自噬相關(guān)蛋白共軛結(jié)合，雙層分隔膜逐漸延伸［9］;需被清除的物質(zhì)(如異常折疊蛋白質(zhì)、損壞細(xì)胞器等)先與底物受體(Cargo receptor，如p62)結(jié)合，然后通過底物受體識別LC3，使底物-底物受體復(fù)合物被逐漸延伸的雙層膜結(jié)構(gòu)包含而形成自噬體(Autophagosome)［10］;自噬泡形成后與溶酶體結(jié)合而形成自噬溶酶體(Autolysosome)，最后在溶酶體酶的作用下，自噬泡膜和其包含物被溶酶體降解，以上過程構(gòu)成一條完整的自噬通路(Autophagy pathyway)，這條自噬通路必須被精密調(diào)控，以保證各環(huán)節(jié)暢通且不過度。在自噬通路中，Phospho-mTOR和Beclin-1是自噬啟動的標(biāo)記，LC3II是自噬泡形成的標(biāo)記，p62則是自噬泡降解的標(biāo)記(圖2)。

目前研究表明自噬參與了胞內(nèi)抗原加工和提呈給MHCⅡ類分子，從而提高細(xì)胞的免疫監(jiān)視效率，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能［11，12］，同時目前研究也表明多種自身免疫性疾病均存在自噬異常的現(xiàn)象［5，13，14］。然而SLE與自噬的相關(guān)研究仍在起步階段，雖已有學(xué)者研究報道SLE患者PBMC自噬泡堆積的現(xiàn)象［4，5］，但由于疾病本身的復(fù)雜性，以及單個核細(xì)胞又包含多種亞型，不同亞群的細(xì)胞其自噬的變化方向(如增強(qiáng)、減弱)和變化水平(或幅度)也可能存在差異，僅對單個核細(xì)胞自噬泡的觀察并不能真正明確SLE中的自噬失調(diào)的狀況。因此，明確單一免疫細(xì)胞亞群的自噬活性顯得更為重要。Th1細(xì)胞功能紊亂及其細(xì)胞因子分泌異常在SLE發(fā)病及其免疫炎性損傷中起到重要作用。在本研究中，我們旨在通過對自噬通路中四個關(guān)鍵自噬標(biāo)記物的檢測，分析SLE患者外周血Th1細(xì)胞自噬情況。

本研究發(fā)現(xiàn)，疾病活動期SLE患者外周血Th1細(xì)胞LC3的表達(dá)水平顯著高于非活動組和正常對照組，提示SLE發(fā)病過程中存在外周血Th1細(xì)胞自噬泡堆積的現(xiàn)象，誘導(dǎo)自噬泡生成增多或抑制自噬泡的降解均可導(dǎo)致自噬泡的堆積，故自噬泡堆積現(xiàn)象并不能真正反映自噬流量的增強(qiáng)或減弱。而本研究發(fā)現(xiàn)各組之間p62的表達(dá)水平無顯著性差異，提示SLE外周血Th1細(xì)胞自噬降解通路通暢。因此我們推測LC3的增多主要由誘導(dǎo)增強(qiáng)所致，即在SLE發(fā)病過程中存在外周血Th1細(xì)胞自噬流量增強(qiáng)的現(xiàn)象。已有文獻(xiàn)證實IFN-γ等Th1細(xì)胞因子可以誘導(dǎo)自噬［14］，且 Dilip 等［15］研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，活動組SLE患者外周血Th1細(xì)胞因子IFN-γ表達(dá)水平均顯著增加，并與SLEDAI評分呈線性相關(guān)關(guān)系。這或許提示在SLE發(fā)病時增多的IFN-γ可能與Th1細(xì)胞自噬流量增強(qiáng)有關(guān)。

已知Phospho-mTOR活性降低說明自噬活性增強(qiáng)，而Beclin-1活性下降則說明自噬被抑制。本研究結(jié)果顯示SLE組的Phospho-mTOR和Beclin-1的表達(dá)水平均顯著低于正常對照組，以Phospho-mTOR降低更為突出，這提示SLE患者外周血Th1細(xì)胞自噬流量的增加可能主要因為mTOR磷酸化受抑制，而Beclin-1對SLE患者外周血Th1細(xì)胞自噬流量的影響可能較小;同時也提示SLE外周血Th1細(xì)胞存在著多種自噬調(diào)節(jié)蛋白的異常，至于哪些自噬調(diào)節(jié)蛋白在其中起主要作用，還需進(jìn)一步探討。

此外，我們研究結(jié)果顯示SLE患者組外周血Th1細(xì)胞Phospho-mTOR的表達(dá)水平與血清補(bǔ)體C3呈正相關(guān)，與SLEDAI評分及Anti-dsDNA均呈負(fù)相關(guān)，這提示Th1細(xì)胞Phospho-mTOR水平與SLE疾病活動相關(guān)，可能成為評判SLE病情活動的指標(biāo)之一。

最后，我們通過將Th1細(xì)胞Phospho-mTOR變化水平與傳統(tǒng)評價指標(biāo)對SLE的活動度評判上進(jìn)行敏感度和特異度的初步比較，得出Th1細(xì)胞自噬相關(guān)標(biāo)記物(Phospho-mTOR)和補(bǔ)體C3的敏感性顯著高于Anti-dsDNA，但特異性相對較差的結(jié)果。當(dāng)然這部分的結(jié)果仍然需要更大樣本量來進(jìn)行檢驗。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)SLE患者Th1細(xì)胞中存在自噬流量增強(qiáng)的現(xiàn)象，其中Th1細(xì)胞Phospho-mTOR的表達(dá)水平與SLE疾病活動相關(guān)，有望成為SLE活動的指標(biāo)之一。而SLE患者Th1細(xì)胞的自噬增強(qiáng)在SLE發(fā)病中的作用尚有待進(jìn)一步研究。

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