Lactobacillus casei胞外多糖對體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、NO及IL-10的影響①

徐智敏 唐彥君 劉 寧

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院乳品科學(xué)教育部重點實驗室，哈爾濱150030)

巨噬細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中占據(jù)著獨一無二的位置，是機體發(fā)揮防御機制的基礎(chǔ)［1］。當(dāng)病原微生物入侵機體時，能夠激活巨噬細(xì)胞分泌炎癥介質(zhì)來殺滅病原微生物，發(fā)揮其防御機制。但是如果巨噬細(xì)胞一直處于激活狀態(tài)會釋放過量的炎癥因子，如NO、TNF-α等，從而造成瀑布式的炎癥失控性反應(yīng)，使組織損傷并成為炎癥［2］。因此，尋找一種能夠調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞活性，改善炎癥反應(yīng)的物質(zhì)，將對維持免疫系統(tǒng)平衡具有重要的意義。Jie-Young Song等人研究發(fā)現(xiàn)人參能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌促炎癥因子IL-1β和IL-6，提高巨噬細(xì)胞的防御能力［3］。但從改善炎癥反應(yīng)方面，抑制這些促炎癥因子的作用卻未見報道。本研究通過采用雙抗體夾心ELISA和Griess法，研究干酪乳桿菌EPS對體外培養(yǎng)的腹腔來源巨噬細(xì)胞分泌促炎癥因子TNF-α和NO及抗炎癥因子IL-10的影響。旨在探討干酪乳桿菌胞外多糖對體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞的雙向調(diào)節(jié)機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 BALB/c雌性小鼠，體質(zhì)量18～20 g，周齡6周，SPF級，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司(批號:2012-021316)，飼養(yǎng)于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院動物實驗中心無特定病原體動物室，環(huán)境溫度24℃，濕度40% ～60%，光照12小時，實驗前先將動物用標(biāo)準(zhǔn)飲食飼養(yǎng)7天以適應(yīng)環(huán)境;J774A.1小鼠單核巨噬細(xì)胞(購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心);干酪乳桿菌(購自于美國ATCC，編號:ATCC393TM);干酪乳桿菌胞外多糖(由本實驗室經(jīng)干酪乳桿菌ATCC393TM發(fā)酵自制，純度為97%);小鼠 TNF-α ELISA檢測試劑盒(Sigma公司);小鼠IL-10 ELISA檢測試劑盒(Sigma公司);LPS(Sigma公司);NO檢測試劑盒(南京建成);DMEM高糖培養(yǎng)液(Hylcone公司)。

1.2 主要儀器 VD-1320型無菌操作臺(北京東聯(lián)哈爾儀器制造廠);HF90型CO2培養(yǎng)箱(HealFroce公司);AE-31型倒置顯微鏡(MOTIC公司);酶聯(lián)免疫檢測儀(美國Bio-Rad公司);真空冷凍干燥機(上海醫(yī)用儀器廠);GL-21M超速冷凍離心機;ZFQ85B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海醫(yī)械專機廠);DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 J774A.1 小鼠單核巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)J774A.1細(xì)胞以1.0×105密度接種于50 ml塑料培養(yǎng)瓶中，用含10%胎牛血清與1%抗生素的DMED高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，2～3天后待細(xì)胞匯合成單層細(xì)胞，用細(xì)胞刮將細(xì)胞輕刮下來，并轉(zhuǎn)移至新的塑料培養(yǎng)瓶中進(jìn)行次代培養(yǎng)。

1.3.2 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的制備與培養(yǎng) 實驗前3天，向小鼠腹腔內(nèi)注射2%淀粉肉湯2 ml，小鼠頸椎脫臼處死，置于75%酒精浸泡3分鐘后取出，腹面朝上，用鑷子提起小鼠下腹部皮膚，剪開一小口，撕開皮膚(小心勿將腹膜撕破)，完全暴露腹膜。用注射器向小鼠腹腔注射6 ml Hanks液，避開腸和脂肪，輕輕地回抽腹腔液，不同方向回抽沖洗數(shù)次(需要5分鐘左右的時間)，吸出腹腔液于離心管中，以1 000 r/min離心5分鐘，棄上清后，用DMEM高糖培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞，置CO2培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)2小時使巨噬細(xì)胞貼壁，然后用PBS洗去懸浮細(xì)胞。更換新鮮的DMEM高糖培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12小時后用于實驗［4］。

1.3.3 設(shè)計及分組 在96孔板中每孔加入細(xì)胞懸液100 μl(1.0×105)，進(jìn)行分組處理，分為空白對照組;胞外多糖處理組;脂多糖處理組;胞外多糖和脂多糖共處理組。

1.3.4 細(xì)胞因子的檢測 收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中 TNF-α、IL-10的濃度，實驗按照ELISA試劑盒操作步驟來進(jìn)行。采用Griess法測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO2－間接反映生成NO的量，按照NO檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 EPS對腹腔巨噬細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響 如圖1和2所示，在倒置顯微鏡下觀察J774A.1巨噬細(xì)胞和原代腹腔巨噬細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)?？瞻讓φ战M，沒有外來物質(zhì)刺激腹腔來源的巨噬細(xì)胞時，細(xì)胞的形態(tài)是圓形的;當(dāng)用炎癥刺激物L(fēng)PS作用細(xì)胞后，腹腔來源的巨噬細(xì)胞形態(tài)發(fā)生較大的變化，由原來的圓形變成梭形，細(xì)胞邊緣有樹突狀突起;用200 μg/ml的EPS處理細(xì)胞后，部分細(xì)胞形態(tài)由梭形、樹突狀恢復(fù)到橢圓形;當(dāng)用400 μg/ml的EPS處理細(xì)胞后大部分細(xì)胞形態(tài)都由梭形、樹突狀恢復(fù)到原來的圓形。說明EPS能夠恢復(fù)由脂多糖導(dǎo)致的巨噬細(xì)胞形態(tài)的變化。

2.2 EPS對腹腔來源巨噬細(xì)胞分泌促炎癥因子TNF-α的影響 如圖3所示，與空白對照組相比，不同濃度的EPS均能顯著地促進(jìn)腹腔巨噬細(xì)胞分泌TNF-α(P ＜0.01);EPS在350 ～ 450 μg/ml濃度范圍內(nèi)，腹腔巨噬細(xì)胞分泌TNF-α的量是先增多后減少，EPS濃度為 400 μg/ml時，J774A.1 和原代腹腔巨噬細(xì)胞分泌 TNF-α的量分別達(dá)到最大值(458.18 ±8.679)pg/ml 和(387.28 ± 8.354)pg/ml。LPS能夠促進(jìn)腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量的TNF-α，與單獨脂多糖組相比，不同濃度的EPS均能抑制由10 μg/ml LPS誘導(dǎo)的TNF-α的分泌;450 μg/ml濃度的EPS對J774A.1和原代腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的抑制率最大。

2.3 EPS對腹腔來源巨噬細(xì)胞分泌抗炎癥因子IL-10的影響 如圖4所示，與空白對照組相比，不同濃度的EPS均能顯著地促進(jìn)腹腔巨噬細(xì)胞分泌IL-10(P ＜0.01);EPS在 350～ 450 μg/ml濃度范圍內(nèi)，腹腔巨噬細(xì)胞分泌IL-10的量是先增多后減少，EPS濃度為400 μg/ml時J774A.1和原代腹腔巨噬細(xì)胞分泌IL-10的量分別達(dá)到最大值(74.18±3.924)pg/ml和(59.761 ±3.46)pg/ml。單獨脂多糖處理組，抑制腹腔巨噬細(xì)胞分泌IL-10，不同濃度的EPS均能顯著影響由10 μg/ml脂多糖導(dǎo)致的IL-10分泌的抑制(P ＜0.01)。

圖1 倒置顯微鏡觀察LPS和EPS對J774A.1細(xì)胞形態(tài)的影響(×400)Fig.1 Morphologic feature of J774A.1 cells treated with EPS and LPS was photographed using an inverted phase microscop(×400)

圖2 倒置顯微鏡觀察LPS和EPS對原代腹腔巨噬細(xì)胞形態(tài)的影響(×200)Fig.2 Morphologic feature of macrophages treated with EPS and LPS was photographed using an inverted phase microscop(×200)

2.4 EPS對腹腔來源巨噬細(xì)胞生成NO的影響如圖5所示，與空白對照組相比，不同濃度的EPS均能顯著地促進(jìn)腹腔巨噬細(xì)胞分泌NO(P＜0.05);EPS在350～450 μg/ml濃度范圍內(nèi)，腹腔巨噬細(xì)胞分泌NO的量是先增多后減少，EPS濃度為400 μg/ml時J774A.1和原代腹腔巨噬細(xì)胞分泌NO量分別達(dá)到最大值(28.191 ±0.697)μmol/L 和(25.969 ±0.587)μmol/L。脂多糖能夠促進(jìn)腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量的NO;與單獨脂多糖組相比，不同濃度的EPS均能抑制由10 μg/ml脂多糖誘導(dǎo)的NO的分泌，450 μg/ml濃度的 EPS對 J774A.1和原代腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的抑制率最高或抑制作用最強。

圖3 EPS對腹腔來源巨噬細(xì)胞分泌促炎癥因子TNF-α的影響Fig.3 Production of the proinflammatory factor TNF-α in culture supernatants of macrophages treated with EPS

圖4 EPS對腹腔來源巨噬細(xì)胞分泌抗炎癥因子IL-10的影響Fig.4 Production of the anti-inflammatory factor IL-10 in culture supernatants of macrophages treated with EPS

圖5 EPS對腹腔來源巨噬細(xì)胞生成NO的影響Fig.5 Production of nitric oxide in culture supernatants of macrophages treated with EPS

3 討論

巨噬細(xì)胞在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，其產(chǎn)生的多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)是炎癥反應(yīng)發(fā)生、發(fā)展、協(xié)調(diào)和消散的內(nèi)在機制［5］。TNF-α是細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的啟動因子，在炎癥反應(yīng)中TNF-α不僅能直接參與炎癥反應(yīng)，還能誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子釋放，共同對組織造成損傷［6］。它與其他細(xì)胞因子形成相互作用的信號網(wǎng)絡(luò)，刺激細(xì)胞合成，表達(dá)IL-1β。IL-1β和TNF-α通過協(xié)調(diào)作用誘發(fā)炎癥反應(yīng)［7］。IL-10能夠抑制單核巨噬細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)，抑制LPS所致的TNF-α、IL-1β、IL-6和 NO 的分泌。此外，它能增強抗炎癥因子的釋放，如IL-1受體拮抗劑和溶解性TNF-α受體［8］。因此IL-10對機體維持穩(wěn)態(tài)平衡發(fā)揮重要的作用。NO是激活的巨噬細(xì)胞殺滅病原微生物及腫瘤細(xì)胞的主要效應(yīng)分子，能提高機體免疫，但過量的NO也會促進(jìn)炎癥發(fā)生，誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子如 TNF-α、IL-1β等。在炎癥反應(yīng)初期，適量的TNF-α、NO是機體對抗炎癥的積極反應(yīng)，但是如果它們持續(xù)不斷地釋放則會導(dǎo)致炎癥的不斷擴大、加重。所以，保持適量的 TNF-α、NO和IL-10等細(xì)胞因子對機體穩(wěn)態(tài)平衡具有重要作用。

近年來大量的研究都集中在真菌多糖、植物多糖對巨噬細(xì)胞的單方向調(diào)節(jié)作用，而食品級乳酸菌胞外多糖對巨噬細(xì)胞的雙向調(diào)節(jié)機制未見報道。Anwei Cheng［1，9］等研究發(fā)現(xiàn)烏拉爾甘草多糖能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子IL-6、IL-12和NO，而LPS能夠促使巨噬細(xì)胞分泌過量的炎癥因子IL-6、IL-12和NO而引發(fā)炎癥反應(yīng)。尋找一種能夠雙向調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞活性，改善炎癥反應(yīng)，維持免疫系統(tǒng)平衡的物質(zhì)將是現(xiàn)在以及未來的研究熱點。

李敏等［10］研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞受IFN-γ等細(xì)胞因子和LPS誘導(dǎo)活化后，會合成并釋放大量TNF-α、IL-1β、IL-6和NO等炎癥介質(zhì)，加重機體的炎癥反應(yīng)，對組織器官造成損傷。此時就需要抑制促炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和 NO 等的過度釋放，并且要促進(jìn)抑炎癥因子如IL-10等的釋放，調(diào)節(jié)并維持機體的穩(wěn)態(tài)平衡。本研究中，EPS激活正常的腹腔巨噬細(xì)胞，促進(jìn)TNF-α、NO及少量的IL-10產(chǎn)生，活化細(xì)胞殺滅病原微生物，發(fā)揮積極作用。LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞后，TNF-α和NO的分泌增加，IL-10分泌急劇減少，加重機體的炎癥反應(yīng)。EPS能抑制經(jīng)LPS處理后巨噬細(xì)胞的活化，維持免疫系統(tǒng)的平衡，因此EPS可能是LPS的抑制劑，EPS可能影響LPS的結(jié)構(gòu)，也有可能EPS和LPS相互作用，發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)形成了一種新的物質(zhì)，LPS和EPS之間的相互作用還有待于進(jìn)一步深入研究。

本研究發(fā)現(xiàn)EPS能夠促進(jìn)正常巨噬細(xì)胞增殖活化并釋放TNF-α、NO和IL-10，增強機體免疫力。當(dāng)巨噬細(xì)胞受LPS誘導(dǎo)活化后，EPS會使TNF-α、NO分泌減少，促進(jìn)IL-10的產(chǎn)生，表明EPS可以通過抑制TNF-α和NO的產(chǎn)生，促進(jìn)IL-10的產(chǎn)生發(fā)揮抗炎作用，進(jìn)一步揭示了干酪乳桿菌胞外多糖通過體外影響腹腔巨噬細(xì)胞的作用發(fā)揮其調(diào)節(jié)免疫的機制。

1 Igor A Schepetkin，Gang Xie，Liliya N Kirpotina.Macrophage immunmodulatory activity of polysaccharides isolated from Opuntia polyacantha［J］.Int Immunopharmacol，2008;8(10):1455-1466.

2 Libby P，Ridker P M，Maseri A.Inflammation and atherosclerosis［J］.Circulation，2002;105(9):1135-1143.

3 Song J Y，Han S K，Son E H et al.Induction of secretory and tumoricidal activities in peritoneal macrophages by ginsan［J］.Int Immunopharmacol，2002;2(7):857-865.

4 Jung A Byun，Mi Hyun Ryu，Jong Kwon Lee.The immunomodulatory effects of 3-monochloro-1，2-propanediol on murine splenocyte and peritoneal macrophage function in vitro［J］.Toxicol In Vitro，2006;20(3):272-278.

5 Jin-Yuarn Lin，Ching-Yin Tang.Strawberry，loquat，mulberry，and bitter melon juices exhibit prophylactic effects on LPS-induced inflammation using murine peritoneal macrophages［J］.Food Chem，2008;107(4):1587-1596.

6 Hasleton P S，Roberts T E.Adult respiralory distress syndrome-an update［J］.Histopathology，1999;34(3):285-294.

7 龐廣昌.食品免疫論-關(guān)于胃腸黏膜免疫和細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的科學(xué)［M］.北京:科學(xué)出版社，2008:479-487.

8 張學(xué)軍，崔雪玲，勞風(fēng)學(xué) et al.激活素A對小鼠巨噬細(xì)胞分泌IL-1β的影響［J］.中國免疫學(xué)雜志，2005;21(8):575-578.

9 Anwei Cheng，F(xiàn)achun Wan，Jiaqi Wang et al.Macrophage immunomodulatory activity of polysaccharides isolated from Glycyrrhiza uralensis fish ［J］.Int Immunopharmacol，2008;8(1):43-50.

10 李 敏，劉耕陶.雙環(huán)醇對脂多糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞iNOS蛋白的表達(dá)和NF-κB活化的抑制作用［J］.中國藥理學(xué)通報，2006;22(12):1438-1443.