雞胚發(fā)育過程N(yùn)-Cadherin和Neurofilament在視頂蓋中的表達(dá)模式研究①

楊慈清 李小英 付蘇雷 趙善廷 林俊堂

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，新鄉(xiāng)453003)

神經(jīng)鈣黏蛋白(N-cadherin)是一種跨模型糖蛋白，在脊椎動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)呈明顯的區(qū)域性［1］，其表達(dá)模式具有明顯的時(shí)空性特點(diǎn)，在胚胎發(fā)育早期主要表達(dá)在細(xì)胞增殖旺盛的區(qū)域，并且在白質(zhì)區(qū)的表達(dá)明顯強(qiáng)于灰質(zhì)區(qū)。N-Cadherin參與神經(jīng)元遷移、神經(jīng)突觸形成、突觸連接等功能［2，3］。神經(jīng)絲蛋白(Neurofilament，NF)可以較靈敏地反映神經(jīng)軸突的形態(tài)變化，是構(gòu)成神經(jīng)元胞體和神經(jīng)軸突細(xì)胞骨架的主要成分，在維護(hù)神經(jīng)元的功能和脊髓損傷修復(fù)相關(guān)的病理生理變化中發(fā)揮著重要作用，故NF作為神經(jīng)骨架蛋白的指標(biāo)可提示神經(jīng)元生長的狀態(tài)［4］。在胚胎發(fā)育過程中，N-Cadherin和 NF在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)具有明顯的相關(guān)性，前期研究結(jié)果表明在脊髓中N-Cadherin和NF表達(dá)呈時(shí)空性變化，最強(qiáng)表達(dá)出現(xiàn)在胚胎發(fā)育的E6-E8時(shí)。本研究對(duì)N-Cadherin和NF在雞胚發(fā)育過程視頂蓋中的表達(dá)模式進(jìn)行研究，從而系統(tǒng)性的分析了NCadherin和NF在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)模式，為進(jìn)一步研究其功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 新鮮種雞蛋(當(dāng)?shù)胤N雞場);一抗Rabbit anti chicken N-Cadherin單克隆抗體(Redies實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng))、Mouse anti Neurofilament(Redies實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng));二抗Goat anti rabbit Cy3標(biāo)記(Molecular Probes);二抗Goat anti mouse FITC標(biāo)記(Jackson ImmunoResearch);Mounting Medium with DAPI(中杉金橋);Nikon ECLIPSE 80i熒光顯微鏡(日本 NI-KON);CM1850冰凍切片機(jī)(德國Leica)。

1.2 方法

1.2.1 雞胚培養(yǎng) 從種雞廠購買新鮮受精雞蛋，當(dāng)天帶回實(shí)驗(yàn)室，用溫水洗凈、擦干，水平放入孵化箱，溫度37.8℃，濕度60%，轉(zhuǎn)蛋間隔2小時(shí)，從孵育第6天(E6)開始收集胚胎，分別在E6-E20，每隔1天取材，各取3個(gè)胚胎。新鮮組織切下視頂蓋，置于4%PFA(多聚甲醛)中，在保溫盒冰內(nèi)搖床搖晃過夜，取出組織，吸干液體，轉(zhuǎn)移到18%蔗糖溶液置冰中搖晃過夜，等沉淀到管底部時(shí)取出組織吸干液體，根據(jù)組織大小，用錫箔紙做好模型，用OCT包埋，注意方向，確定冠狀切面的位置，置于液氮中冷凍后放-80℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 切片 從-80℃冰箱取出已包埋的組織，在冰凍切片機(jī)上連續(xù)切片，冠狀切片，一次10張載玻片，每張片子根據(jù)組織大小循環(huán)貼2行，5～10列，切片后置烤片機(jī)37℃烤片30分鐘以上，置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 熒光免疫組織化學(xué) 從-80℃低溫冰箱中取出的冰凍切片40℃干燥20分鐘，4%PFA中4℃固定15分鐘，用1×TBS(Tris緩沖鹽水:10 mmol/L的 Tris含0.9%NaCl，用1 mol/L HCl調(diào) pH 至7.4)清洗3次，每次5分鐘，在含0.1%Triton X-100的1×TBS中再孵育5分鐘。每張載玻片上加1 ml免疫組化封閉液，濕盒中孵育1小時(shí)。去除封閉液后每張載玻片加300 μl經(jīng)用封閉液稀釋的合適濃度抗N-Cadherin(1∶500)一抗，4℃孵育過夜后，1×TBS清洗3次，每次5分鐘，然后每張片加300 μl封閉液稀釋的Cy3標(biāo)記的針對(duì)一抗的二抗(1∶500稀釋)，室溫孵育1小時(shí)后，用1×TBS清洗3次，每次5分鐘。然后加抗 NF(1∶100)一抗，4℃孵育過夜后，1×TBS清洗3次，每次5分鐘，然后每張片加300 μl封閉液稀釋的用FITC標(biāo)記的針對(duì)一抗的二抗(1∶500稀釋)，室溫孵育1小時(shí)后，用1×TBS清洗3次，每次5分鐘。最后滴加DAPI封片劑染色10分鐘，加蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察拍照，用Photoshop CS3軟件處理圖片，可將3種染色同位拼合在一起，從而分析不同蛋白質(zhì)的表達(dá)定位。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)鈣黏蛋白的表達(dá)模式 雞胚發(fā)育到E6時(shí)，通過冰凍切片，可以看到(圖1C)視頂蓋已經(jīng)形成明顯的3層結(jié)構(gòu)，此時(shí)，檢測(cè)N-Cadherin的表達(dá)結(jié)果顯示，N-Cadherin主要在神經(jīng)上皮(Neuroepithelium，NE)和新生區(qū)(Generative zone，GZ)兩層呈強(qiáng)陽性表達(dá)。而在E8時(shí)(圖1G)，視頂蓋明顯增厚，并且出現(xiàn)新的層，此時(shí)N-Cadherin除在NE層強(qiáng)表達(dá)外，在邊沿區(qū)(marginal zone，mZ)的表達(dá)也很強(qiáng)。在E10時(shí)(圖1K)，N-Cadherin主要分布在NE、視神經(jīng)層(Presumptive stratum opticum，PSO)、前表面灰質(zhì)纖維層(Presumptive stratum griseum and fibrosum superficiale，PSGFS)和亞室管膜層(Sub-ventricular zone，SVZ)。E12之后視頂蓋6層的結(jié)構(gòu)基本形成，只是表面灰質(zhì)纖維層(Stratum griseum fibrosum superficiale，SGFS)層各亞層到E18時(shí)才能夠全部形成，從圖(圖1N-F’)中可以看到，N-Cadherin在E12之后各層都有不同強(qiáng)度的表達(dá)，但相對(duì)而言，在中央灰質(zhì)層(Stratum griseum central，SGC)的表達(dá)較弱，而在SGFS層的表達(dá)最強(qiáng)，但在SGFS層并不是均一表達(dá)，而呈現(xiàn)明顯的層的結(jié)構(gòu)，因?yàn)樵赟GFS層進(jìn)一步可以分a-j等10個(gè)亞層，每層的細(xì)胞類型和大小都是不同的，是結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜的一層，但是，無論是在胚胎發(fā)育的早期，還是后期，N-Cadherin主要表達(dá)在細(xì)胞核密度較小的區(qū)域，這也告訴我們N-Cadherin雖然是一種跨膜性糖蛋白，但是在神經(jīng)纖維中的表達(dá)量明顯要高，由此，我們對(duì)神經(jīng)絲蛋白的表達(dá)模式進(jìn)行了同步分析。

2.2 神經(jīng)絲蛋白的表達(dá)模式及其與N-Cadherin表達(dá)的異同 在E6時(shí)神經(jīng)絲蛋白(Neurofilament，NF)明顯的可以看到表達(dá)在GZ層(圖1B)，而該層結(jié)構(gòu)也是新生層，是纖維密集分布的區(qū)域;在E8時(shí)主要表達(dá)在IZ層(圖1F);在E10時(shí)(圖1J)，在前視神經(jīng)層(Presumptive stratum opticum，PSO)的表達(dá)很強(qiáng)，除此，在SVZ區(qū)也有明顯的表達(dá)，此時(shí)NF的表達(dá)明顯的與N-Cadherin的部分表達(dá)恰好重疊(圖1L)。從E12之后，NF主要表達(dá)在SAC層和SO層，與N-Cadherin只在這兩層結(jié)構(gòu)上重疊，在E14之后，表達(dá)強(qiáng)度減弱，在E20時(shí)仍然在SAC層和SO層上能夠檢測(cè)到其表達(dá)。為了更清楚地標(biāo)記視頂蓋SGFS層，用Brn2單克隆抗體標(biāo)記視頂蓋Ⅱ-Ⅲ層(圖1H’)，從結(jié)果可以看到，Brn2是一種細(xì)胞核抗原，抗體識(shí)別并標(biāo)記出SGFS和SGC兩層的細(xì)胞核，但此時(shí)仍然很難清楚地分出SGFS層各亞層的結(jié)構(gòu)。

圖1 N-Cadherin和NF表達(dá)模式Fig.1 The patterns of N-Cadherin and neurofilament expression

3 討論

胚胎發(fā)育早期在中樞神經(jīng)系統(tǒng)有眾多的蛋白開始表達(dá)，N-Cadherin和NF是其中兩種，并且二者的表達(dá)存在相關(guān)性，N-Cadherin和NF主要分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的白質(zhì)區(qū)和神經(jīng)纖維密集分布的區(qū)域，并且NF的表達(dá)與神經(jīng)功能的形成具有密切的關(guān)系［5］，雞胚視頂蓋是視神經(jīng)密集分布的組織結(jié)構(gòu)，是研究神經(jīng)元遷移的理想部位，因此本研究對(duì)視頂蓋中N-Cadherin和NF的表達(dá)模式進(jìn)行了系統(tǒng)性的研究。從N-Cadherin和NF的表達(dá)模式上可以看出，二者部分區(qū)域存在共表達(dá)的模式，NF表達(dá)的區(qū)域同樣有N-Cadherin的表達(dá)。如SO層，該層結(jié)構(gòu)是視神經(jīng)密集分布的一層，視頂蓋神經(jīng)傳輸?shù)淖顬橹匾囊粚咏Y(jié)構(gòu)，在該層二者的表達(dá)都很強(qiáng)，并且從結(jié)果上可以看出，二者在胚胎發(fā)育前期的表達(dá)明顯高于后期，是由于在胚胎發(fā)育前期是神經(jīng)元形成、成熟和遷移的重要階段，神經(jīng)元的遷移需要神經(jīng)纖維的幫助，也提示N-Cadherin和NF在細(xì)胞遷移方面具有重要功能。N-Cadherin主要的功能是起到細(xì)胞之間黏著作用，除此之外，也有報(bào)道N-Cadherin參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的分區(qū)、形態(tài)發(fā)生和神經(jīng)纖維的投射等眾多功能［6］。最新研究報(bào)道N-Cadherin是多級(jí)神經(jīng)元遷移過程中的關(guān)鍵分子［7］，受神經(jīng)元遷移關(guān)鍵分子的Reelin調(diào)控［8］。N-Cadherin主要影響非膠質(zhì)細(xì)胞依賴性神經(jīng)元的遷移，同時(shí)也對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞依賴性的神經(jīng)元遷移具有調(diào)控功能［9］。為了更清楚研究N-Cadherin的功能，我們對(duì)N-Cadherin在雞胚中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)模式進(jìn)行研究，在準(zhǔn)確掌握其表達(dá)模式的基礎(chǔ)上研究N-Cadherin的功能。結(jié)果表明，N-Cadherin在胚胎發(fā)育早期的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中就有強(qiáng)的表達(dá)，而且具有明顯的時(shí)空性，在脊髓中從胚胎發(fā)育E4開始，到E6-E8時(shí)達(dá)到高峰，而在視頂蓋中的表達(dá)從能夠進(jìn)行切片的E6開始，就可以檢測(cè)到強(qiáng)的表達(dá)，并且有明顯的層的分布，在不同層中的表達(dá)強(qiáng)度各不相同。因此，從表達(dá)模式上來看，要準(zhǔn)確研究N-Cadherin在活體內(nèi)的功能，必須從胚胎發(fā)育的早期進(jìn)行N-Cadherin的超異常表達(dá)。Kadowaki等［10］通過條件型基因敲除方法對(duì)NCadherin在小鼠大腦皮層形成過程的功能進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，N-Cadherin沉默后，影響小鼠大腦皮層各層細(xì)胞的正確分布，并且改變海馬區(qū)的組織學(xué)結(jié)構(gòu)，N-Cadherin是胚胎發(fā)育過程中非常重要的分子，實(shí)現(xiàn)完全敲除后會(huì)影響胚胎的發(fā)育，采用RNAi技術(shù)實(shí)現(xiàn)部分沉默是研究其功能的理想模式。NCadherin和NF是在胚胎發(fā)育早期開始強(qiáng)表達(dá)的兩種分子，對(duì)其功能的研究，在活體動(dòng)物體內(nèi)，可以采用基因沉默的模型，相對(duì)而言對(duì)于自身高表達(dá)的蛋白如果進(jìn)行基因超表達(dá)模型效果將不是很理想;另外，N-Cadherin在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用，因此，要研究N-Cadherin的功能，闡明N-Cadherin的相關(guān)調(diào)控分子及其調(diào)控機(jī)制至關(guān)重要。

致謝:感謝德國耶拿大學(xué)Redies教授在實(shí)驗(yàn)過程中給予Ncdh和NF抗體的饋贈(zèng)和實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)!

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