氯化甲基汞誘導(dǎo)大鼠不同發(fā)育階段腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡①

郭 杰 張?chǎng)┢G 劉忠山 李志超 王鐵君 邢 程

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院放療科，長(zhǎng)春130041)

甲基汞污染已成為當(dāng)今全球性問(wèn)題，長(zhǎng)期食用受甲基汞污染的海產(chǎn)品會(huì)造成低劑量汞暴露對(duì)人類健康的危害，特別是對(duì)胎、幼兒腦發(fā)育的損傷作用倍受各國(guó)學(xué)者的關(guān)注［1，2］。過(guò)去的半個(gè)多世紀(jì)，許多學(xué)者對(duì)甲基汞的神經(jīng)毒作用機(jī)制進(jìn)行了大量的研究，但迄今確切的分子機(jī)制尚不十分明了。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)理論和技術(shù)的不斷發(fā)展，基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和信號(hào)傳導(dǎo)通路等已成為生物醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)，相關(guān)交叉學(xué)科引人注目的研究成就，有助于我們對(duì)甲基汞所致腦發(fā)育損傷的理解，使我們的研究工作也由原來(lái)整體、細(xì)胞水平不斷向分子層次深入。本文通過(guò)觀察氯化甲基汞(MMC)誘導(dǎo)大鼠不同發(fā)育階段腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡，旨在揭示甲基汞致腦發(fā)育損傷的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 MMC購(gòu)于德國(guó)Merck公司，F(xiàn)V500激光共聚焦顯微鏡(Olympus，日本)。原位雜交檢測(cè)試劑盒，武漢博士德生物公司

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雌性 Wistar大鼠，體重(120±20)g。隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組30只。實(shí)驗(yàn)組大鼠從妊娠前90天至仔鼠出生后30天連續(xù)喂飼含有不同劑量(Exp1:0.75、Exp2:1.50和Exp3:3.00 mg/kg)MMC的普通飼料，對(duì)照組給予普通飼料。

1.3 組織制備 仔鼠分別在出生后第3、7、14、21和30天，斷頭處死取腦，沿矢狀縫切開(kāi)，4%多聚甲醛固定液固定腦組織，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟浸透，包埋。腦組織切片厚度為5 μm。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 石蠟切片常規(guī)二甲苯脫蠟，乙醇梯度復(fù)水，切片置于0.85%NaCl中，室溫5分鐘，PBS洗滌5分鐘，4%的多聚甲醛室溫固定15分鐘，PBS洗滌5分鐘，除去 PBS，滴加100 μl終濃度為20 μg/ml蛋白酶K，室溫下消化5分鐘，室溫下PBS洗滌5分鐘，4%的多聚甲醛固定15分鐘，PBS洗滌5分鐘除去PBS，滴加平衡緩沖液后覆蓋專用蓋片，室溫10分鐘每張切片滴加50 μl TdT孵育緩沖液，蓋片封閉。(陰性對(duì)照切片省略此步)，避光潮濕條件下37℃，60分鐘，小心揭去蓋片，2×SSC洗滌15分鐘后，PBS洗滌兩次，每次5分鐘，切片置于PI染液中10分鐘，雙蒸水洗滌兩次，每次5分鐘，專用封片劑封片后4℃避光保存，激光共聚焦顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞。所有細(xì)胞在＞620 nm激發(fā)光下，細(xì)胞胞漿呈現(xiàn)強(qiáng)紅色熒光，凋亡細(xì)胞在(520±20)nm激發(fā)光下，呈現(xiàn)強(qiáng)綠色熒光，在(520±20)nm及620 nm激發(fā)光下呈現(xiàn)強(qiáng)黃色熒光。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組出生后不同時(shí)間點(diǎn)仔鼠腦神經(jīng)元凋亡情況 見(jiàn)表1～3及圖1～3。實(shí)驗(yàn)采用熒光原位末端標(biāo)記的方法，觀察MMC對(duì)腦神經(jīng)元凋亡的影響，結(jié)果以凋亡細(xì)胞陽(yáng)性率表示。如表1～3所示，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組出生后不同時(shí)間點(diǎn)仔鼠腦神經(jīng)元都存在凋亡。隨仔鼠腦汞含量的增加，大腦、小腦和海馬神經(jīng)元凋亡均明顯增加(P＜0.05)。提示長(zhǎng)期接觸低劑量氯化甲基汞致腦發(fā)育損傷與其誘導(dǎo)神經(jīng)元過(guò)渡凋亡有關(guān)。

表1 對(duì)照組和不同MMC濃度實(shí)驗(yàn)組仔鼠小腦PCD變化(±s，n=4)Tab.1 Changes of PCD positive cells in developing rat cerebellum from control and different concentrations of MMC exposure groups(±s，n=4)

表1 對(duì)照組和不同MMC濃度實(shí)驗(yàn)組仔鼠小腦PCD變化(±s，n=4)Tab.1 Changes of PCD positive cells in developing rat cerebellum from control and different concentrations of MMC exposure groups(±s，n=4)

Note:1)P ＜0.05，vs control group.

PND3 PND7 PND14 PND21 PND30 Control 4.85 ±0.75 5.25 ±0.87 5.88 ±0.95 5.87 ±Groups Positive cells(%)1.55 6.00 ±0.91 Exp1 11.13 ±4.491) 12.63 ±3.031) 13.75 ±5.631) 13.63 ±4.661) 14.13 ±2.291)Exp2 20.63 ±6.401) 21.75 ±6.031) 21.88 ±6.411) 22.87 ±7.451) 24.63 ±8.821)Exp3 34.75 ±8.781) 35.38 ±7.691) 36.13 ±6.521) 38.50 ±8.451) 40.38 ±4.151)

表2 對(duì)照組和不同MMC濃度實(shí)驗(yàn)組仔鼠海馬PCD變化(±s，n=4)Tab.2 Changes of PCD positive cells in developing rat hippocampus from control and different concentrations of MMC exposure groups(±s，n=4)

表2 對(duì)照組和不同MMC濃度實(shí)驗(yàn)組仔鼠海馬PCD變化(±s，n=4)Tab.2 Changes of PCD positive cells in developing rat hippocampus from control and different concentrations of MMC exposure groups(±s，n=4)

Note:1)P ＜0.05 vs control group.

PND3 PND7 PND14 PND21 PND30 Control 4.38 ±0.75 5.38 ±0.69 5.75 ±0.96 5.63 ±Groups Positive cells(%)1.44 6.13 ±1.11 Exp1 11.38 ±2.691) 12.12 ±2.981) 13.50 ±2.681) 13.13 ±2.751) 13.63 ±1.251)Exp2 19.63 ±6.251) 21.63 ±5.861) 21.25 ±5.301) 22.25 ±6.601) 24.87 ±8.091)Exp3 33.63 ±4.371) 34.13 ±6.701) 36.75 ±5.611) 37.88 ±1.441) 40.63 ±3.331)

表3 對(duì)照組和不同MMC濃度實(shí)驗(yàn)組仔鼠大腦PCD變化(±s，n=4)Tab.3 Changes of PCD positive cells in developing rat cerebra from control and different concentrations of MMC exposure groups(±s，n=4)

表3 對(duì)照組和不同MMC濃度實(shí)驗(yàn)組仔鼠大腦PCD變化(±s，n=4)Tab.3 Changes of PCD positive cells in developing rat cerebra from control and different concentrations of MMC exposure groups(±s，n=4)

Note:1)P ＜0.05 vs control group.

PND3 PND7 PND14 PND21 PND30 Control 5.13 ±0.48 5.63 ±1.18 5.88 ±1.11 5.94 ±Groups Positive cells(%)1.29 6.25 ±1.32 Exp1 11.63 ±2.461) 11.88 ±2.501) 12.25 ±3.951) 13.13 ±2.901) 13.88 ±1.881)Exp2 20.13 ±5.951) 20.88 ±5.381) 21.75 ±3.231) 22.88 ±5.451) 23.94 ±2.931)Exp3 31.75 ±2.751) 32.88 ±4.821) 34.25 ±3.381) 35.38 ±3.591) 37.88 ±3.041)

2.2 激光共聚焦顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞情況 圖4所示:應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察時(shí)，凋亡細(xì)胞在(520±20)nm激發(fā)光下，細(xì)胞核呈現(xiàn)強(qiáng)綠色熒光(圖4AⅠ、BⅠ)，在(520±20)nm及620 nm激發(fā)光的共同激發(fā)下，細(xì)胞核呈現(xiàn)強(qiáng)黃色熒光，胞漿呈現(xiàn)紅色熒光(圖4AⅡ、BⅡ)。所有細(xì)胞在＞620 nm激發(fā)光下，細(xì)胞胞漿呈現(xiàn)強(qiáng)紅色熒光(圖4AⅢ)。在激光共聚焦顯微鏡下計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組出生后不同時(shí)間點(diǎn)仔鼠小腦、大腦發(fā)生凋亡的神經(jīng)元，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組出生后不同時(shí)間點(diǎn)仔鼠腦神經(jīng)元都存在凋亡。

圖1 對(duì)照組和不同MMC濃度實(shí)驗(yàn)組仔鼠小腦PCD變化Fig.1 Changes of PCD positive cells in developing rat cerebellum from control and different concentrations of MMC exposure groups

圖2 對(duì)照組和不同MMC濃度實(shí)驗(yàn)組仔鼠海馬PCD變化Fig.2 Changes of PCD positive cells in developing rat hippocampus from control and different concentrations of MMC exposure groups

圖3 對(duì)照組和不同MMC濃度實(shí)驗(yàn)組仔鼠大腦PCD變化Fig.3 Changes of PCD positive cells in developing rat cerebra from control and different concentrations of MMC exposure groups

3 討論

在過(guò)去的半個(gè)多世紀(jì)，許多學(xué)者就長(zhǎng)期接觸低劑量甲基汞對(duì)腦發(fā)育損傷機(jī)制，從誘導(dǎo)自由基產(chǎn)生、改變細(xì)胞內(nèi)Ca2+環(huán)境、影響蛋白質(zhì)磷酸化、干擾線粒體功能、抑制核酸和蛋白質(zhì)合成等生物化學(xué)方面作了大量的研究工作［3-5］。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)理論和技術(shù)的飛速發(fā)展，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)甲基汞所致腦發(fā)育損傷機(jī)制的研究也不斷向分子層次深入。我們認(rèn)為甲基汞所致腦發(fā)育損傷與其活化特殊信號(hào)分子、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)，抑制發(fā)育階段神經(jīng)元增殖有密切關(guān)系。

圖4 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組(Exp3)仔鼠PCD變化Fig.4 Photograph showing PCD positive cells in developing rat brain from control and Exp3 group

本研究采用熒光原位末端標(biāo)記法，在激光共聚焦顯微鏡下計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組出生后不同時(shí)間點(diǎn)仔鼠大腦、小腦和海馬區(qū)發(fā)生凋亡的神經(jīng)元，以PCD陽(yáng)性率表示凋亡的多少。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組出生后不同時(shí)間點(diǎn)仔鼠腦神經(jīng)元都存在凋亡。但隨仔鼠腦汞含量的增加，在大腦、小腦和海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡均明顯增加。以小腦為例:出生后3天，實(shí)驗(yàn)組1(Exp1)，實(shí)驗(yàn)組2(Exp2)和實(shí)驗(yàn)組3(Exp3)仔鼠小腦神經(jīng)元凋亡率與對(duì)照組相比，分別增加了6.28%、14.23%和29.9%;在出生后7天，分別增加了7.38%、16.5%和30.13%;出生后14天，分別增加了7.87%、16%和30.25%;出生后21天，分別增加了7.76%、17%和32.63%;出生后 30天，分別增加8.13%、18.63%和34.38%。細(xì)胞凋亡是生物體細(xì)胞受基因精確調(diào)控的主動(dòng)消亡過(guò)程。在正常腦發(fā)育過(guò)程中會(huì)有一定數(shù)量的神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡，這是機(jī)體維持一定細(xì)胞數(shù)量和神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育成熟的需要。但是由外界刺激引發(fā)的過(guò)度凋亡則會(huì)造成病理?yè)p害和功能異常。既往研究發(fā)現(xiàn):甲基汞可引起脾臟、卵巢、肝臟及小腦顆粒細(xì)胞和蒲肯野細(xì)胞等多種細(xì)胞發(fā)生凋亡。這種凋亡是病理性的。我們分析甲基汞誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡可能有以下機(jī)制參與:(1)甲基汞能破壞神經(jīng)元內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，引起神經(jīng)元內(nèi)Ca2+濃度升高，Ca2+作為第二信使可引起信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中與凋亡相關(guān)的信號(hào)分子(如PKC、MAPK)等的激活，調(diào)節(jié)核內(nèi)基因表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。(2)甲基汞在亞細(xì)胞水平上主要分布在線粒體，甲基汞可通過(guò)影響線粒體滲透性和膜電位以及細(xì)胞色素C釋放級(jí)聯(lián)激活Caspase-9和Caspase-3等，誘導(dǎo)凋亡。(3)產(chǎn)生自由基，作用于核酸，引起堿基的修飾和DNA斷裂，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。綜上所述，甲基汞誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡是由多種分子參與，由多重信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)調(diào)控的。對(duì)于在mRNA與蛋白水平上檢測(cè)甲基汞引起大鼠神經(jīng)元凋亡的相關(guān)信號(hào)通路因子的變化情況，我們將進(jìn)一步研究。

1 郭 杰，王鐵君，張?chǎng)┢Get al.氯化甲基汞對(duì)發(fā)育階段大鼠海馬組織蛋白激酶C活性的影響［J］吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2010;36(5):922-925.

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