人臍血來源CD34+內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及集落形成特性①

李國強(qiáng) 劉珍珍 孫晟軒 安廣宇 周海斌

(蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨外科，蘇州215004)

自1997年Asahara等［1］首次在成人外周血中發(fā)現(xiàn)循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial progenitor cells，EPCs)，使人們對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞的定義和血管形成的概念有了新的認(rèn)識(shí)。血管發(fā)生是一個(gè)高度調(diào)控的過程，并且在胚胎發(fā)育、組織修復(fù)與再生中起著重要作用，其中EPCs在這些過程中可能扮演著重要角色［2］。EPCs具有自我增殖、定向分化的特性，可定向分化為血管、內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管新生、修復(fù)損傷內(nèi)膜，在血管組織工程、冠心病的診斷治療上有廣闊的臨床應(yīng)用前景［3-5］。

對(duì)于EPCs的定義國內(nèi)外存有爭議，現(xiàn)有“兩種EPCs”，一種為形態(tài)上呈“紡錘樣”的 CFU-ECs，另一種則是呈“鵝卵石樣”的 ECFCs［6，7］。目前國際上常用的鑒定EPCs的方法是通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面一些分子抗原的表達(dá)，如CD34、CD133和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體(VEGFR-2)［1，8］。但隨著細(xì)胞的分化，細(xì)胞表面抗原也不斷發(fā)生變化，其中CD34、CD133在細(xì)胞體外培養(yǎng)的過程中會(huì)逐漸消失［9］，而內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物VEGFR-2的表達(dá)逐漸增強(qiáng)。因造血干細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞來源于同一前體細(xì)胞，即成血管細(xì)胞，在其分化過程中可能存在部分相同的細(xì)胞表面抗原［10］，因此單純通過細(xì)胞表面抗原來鑒定EPCs并不準(zhǔn)確。本文通過細(xì)胞表面抗原鑒定、細(xì)胞增殖能力、集落形態(tài)、次級(jí)集落形成及體外成血管等方法對(duì)兩種EPCs進(jìn)行鑒定，區(qū)別 ECFCs和 CFU-ECs，進(jìn)而對(duì)EPCs建立一個(gè)正確、統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臍血來源 收集6名健康新生產(chǎn)婦臍血，每份約40～100 ml。所有產(chǎn)婦及其家屬均知情并同意。

1.1.2 試劑與儀器 Ficoll淋巴細(xì)胞分離液購自Cedarlane公司，CD34磁珠分選試劑及儀器購自stem cell公司，流式細(xì)胞分析儀、VEGFR-2-PE、CD31-PE、 CD144-PE、 CD133-FITC、 CD34-FITC，CD105-FITC、CD146-FITC、CD14-FITC、CD45-PerCP、Matrigel膠購自BD公司，熒光二抗購自Invitrogen，智能生物圖像導(dǎo)航儀FSX100購自O(shè)LYMPUS，EBM-2培養(yǎng)基購自MD公司，胎牛血清購自Gibco公司。

1.2 細(xì)胞分離培養(yǎng) 從自愿捐獻(xiàn)者臍靜脈上抽取臍血50 ml左右，肝素抗凝，用等量的PBS稀釋，按2∶1比例加在Ficoll淋巴細(xì)胞分離液上，2 600 r/min離心30分鐘，取中間白膜層，用PBS洗滌2遍，計(jì)數(shù)。用Easysep免疫磁珠(MACS)人CD34細(xì)胞正選試劑篩選CD34+的細(xì)胞接種于用纖粘連蛋白(FN)包被的培養(yǎng)皿中，含10%FBS的EGM-2培養(yǎng)基培養(yǎng)。48小時(shí)后將未貼壁細(xì)胞及細(xì)胞碎片移出到新包被培養(yǎng)皿中，48小時(shí)后細(xì)胞貼壁并換液。原培養(yǎng)皿中貼壁細(xì)胞前7天每天更換新鮮培養(yǎng)基，以后隔天換液。見圖1。

1.3 EPCs的鑒定

1.3.1 流式分析 1×105個(gè)生長狀態(tài)良好的5代以內(nèi)細(xì)胞與1%BSA稀釋的抗體 VEGFR2-PE、CD31-PE、 CD144-PE、 CD133-FITC、 CD34-FITC、CD105-FITC、CD146-FITC、CD14-FITC、CD45-PerCP(100 μl/管)，在冰上避光孵育40分鐘，繼而加1 ml的PBS洗2次，混勻后1 500 r/min離心5分鐘。棄上清，加500 μl PBS重懸細(xì)胞。流式細(xì)胞儀分析，每個(gè)樣本收集分析10 000個(gè)細(xì)胞。

1.3.2 細(xì)胞免疫熒光 接種細(xì)胞與干凈的蓋玻片上，過夜貼壁后，用4%多聚甲醛固定10分鐘;冷PBS洗一遍，100 μl 1%BSA封閉1小時(shí)，分別加抗人CD31、vWF、CD144的鼠單克隆抗體，孵育45分鐘，PBS洗一遍，再加上Alexa 488羊抗鼠二抗，4℃避光孵育20分鐘;PBS洗2次，蒸餾水洗1次，用含DAPI染色劑的封片劑封片后共聚焦顯微鏡下觀察。

1.4 吞噬DiI-Ac-LDL能力 取生長狀態(tài)良好的5代以內(nèi)細(xì)胞，將細(xì)胞與 DiI-AC-LDL(10 μg/ml)在37℃孵育1小時(shí)，4%的多聚甲醛固定，37℃孵育1小時(shí)，PBS沖洗3次，蒸餾水洗1次，向已染色的標(biāo)本上滴加DAPI，然后再滴加50%緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.5 Matrigel的體外血管形成 提前將Matrigel及48孔板放于4℃冰箱過夜，48孔板中每孔加入150 μl Matrigel，放到37℃培養(yǎng)箱中30分鐘。每孔接種4×104個(gè)細(xì)胞，靜置5分鐘后放到細(xì)胞培養(yǎng)箱中。每隔3小時(shí)于倒置顯微鏡下觀察血管形成情況。

2 結(jié)果

2.1 EPCs形態(tài)特征和集落形成 我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過CD34+免疫磁珠篩選獲得的EPCs分為貼壁細(xì)胞和未貼壁細(xì)胞，其形態(tài)完全不同。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞，在細(xì)胞大小、增殖能力、集落形態(tài)和集落形成時(shí)間等方面存在很大差異，根據(jù)其上述特性將貼壁細(xì)胞命名 ECFCs，未貼壁細(xì)胞命名為 CFU-ECs。ECFCs在分離培養(yǎng)5～14天時(shí)形成少量形態(tài)為典型“鋪路石”樣的細(xì)胞集落。通過每隔3天用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的集落形成及增殖過程，發(fā)現(xiàn)14～21天有多個(gè)集落形成，ECFCs在傳到25代時(shí)仍具有很強(qiáng)的增殖能力。CFU-ECs在4～10天左右出現(xiàn)少量細(xì)胞，呈“紡錘體樣”或“梭形”，貼壁梭形細(xì)胞從中央向周圍呈放射狀生長，且有梭形細(xì)胞排列呈線狀，分別在4、11、18天觀察，未見集落生成，10代左右CFU-ECs生長增殖能力明顯下降。以往研究認(rèn)為，ECFCs與CFU-ECs在體內(nèi)或者體外能否形成次級(jí)內(nèi)皮集落形成是判定細(xì)胞增殖能力及是否為EPCs的重要指標(biāo)［12］。我們研究發(fā)現(xiàn)，ECFCs在體外可以形成次級(jí)內(nèi)皮克隆集落，而CFU-ECs不能，這一點(diǎn)也證明 CFU-ECs并非真正的 EPCs，見圖2。

圖1 ECFCs和CFU-ECs的分離和培養(yǎng)Fig.1 Endothelial cells isolated and cultured

圖2 CFU-ECs和ECFCs的細(xì)胞集落形成能力Fig.2 The ability of colony formation in two cells

2.2 流式及細(xì)胞免疫熒光及 RT-PCR 流式結(jié)果發(fā)現(xiàn)ECFCs和CFU-ECs共同表達(dá)部分內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志，如 CD31、CD105、CD146和 VEGFR-2等內(nèi)皮標(biāo)志，結(jié)果見圖3A。但CFU-ECs表面造血干細(xì)胞標(biāo)志 CD45和吞噬細(xì)胞標(biāo)志CD14高表達(dá)，而ECFCs CD34陽性率達(dá)75%，CD14及CD45陽性率較低，分別為5%和9%(圖3B)。

圖3 第4代的ECFCs和CFU-ECs的流式檢測結(jié)果Fig.3 The expression of different molecular in two cells

圖4 免疫熒光檢測及RT-PCR測定ECFCs和CFU-ECs CD31、CD144和vWF的表達(dá)Fig.4 The expression of different molecules in immunofluorescence and RT-PCR

圖5 ECFCs和CFU-ECs攝取DiL-Ac-LDL能力Fig.5 The ability of ECFCs and CFU-ECs intake DiLAc-LDL

圖6 ECFCs和CFU-ECs成血管能力對(duì)照Fig.6 The ability of ECFCs and CFU-ECs into vascular

細(xì)胞免疫熒光證實(shí)兩種細(xì)胞表面均有CD31、CD144、vWF的陽性表達(dá)，與流式檢測結(jié)果相符，見圖4A。RT-PCR檢測兩種細(xì)胞 CD34a、CD34b、CD144、VEGFR-2、vWF、CD31 在 mRNA 水平的表達(dá)，結(jié)果與上述流式及免疫熒光結(jié)果相一致，見圖4B。上述結(jié)果說明ECFCs和CFU-ECs許多細(xì)胞表面標(biāo)志相同，鑒定細(xì)胞標(biāo)志物并非是鑒定EPCs的金標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 DiI-Ac-LDL攝取實(shí)驗(yàn) 圖5為ECFCs和CFUECs攝取Dil-Ac-LDL能力的比較，可以看出兩種細(xì)胞都有一定的攝取能力，但ECFCs攝取能力明顯強(qiáng)于CFU-ECs，90%以上 ECFCs可以攝取 DiL-Ac-LDL。由于 CFU-ECs表面作為吞噬細(xì)胞標(biāo)志的CD14陽性率約99%，所以其攝取能力可能為吞噬細(xì)胞對(duì)Dil-Ac-LDL的吞噬作用。

2.4 血管形成 圖6為兩種細(xì)胞成血管情況，發(fā)現(xiàn)ECFCs在3小時(shí)時(shí)已見明顯血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成，而CFU-ECs在9小時(shí)時(shí)仍未見血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，說明CFU-ECs無血管生成能力。

3 討論

臨床研究結(jié)果普遍支持自體EPCs在組織缺血以及損傷血管修復(fù)的治療方面具有極大的潛力［11］，但外周血中EPCs的數(shù)量極少，沒有足夠細(xì)胞量來滿足臨床應(yīng)用。而臍血具有取材無創(chuàng)傷、資源豐富、富含早期干細(xì)胞等諸多優(yōu)點(diǎn)。Asahara首次在成人外周血中發(fā)現(xiàn)循環(huán)EPCs，但關(guān)于ECFCs和CFU-ECs哪一種為真正的EPCs及EPCs的標(biāo)準(zhǔn)鑒定方法一直存在爭議［12］。本研究選擇從臍血中分離擴(kuò)增EPCs，通過多種方法鑒定ECFCs和CFU-ECs。這兩種細(xì)胞來源于不同的祖細(xì)胞，CFU-ECs可能來源于造血干細(xì)胞。ECFCs的分子表面標(biāo)記、增殖能力、次級(jí)集落形成、攝食Dil-Ac-LDL及成血管能力，推斷其可能為真正的EPCs。

EPCs與心血管疾病相關(guān)，已成為一種新型的評(píng)估心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的細(xì)胞生物標(biāo)記［13，14］。研究表明，隨著冠心病的Framinghan危險(xiǎn)因素評(píng)分的增加，血管中循環(huán)EPCs的數(shù)量逐漸減少，相反在缺血和動(dòng)脈粥樣硬化后的恢復(fù)過程中EPCs數(shù)量增加。國外學(xué)者認(rèn)為EPCs數(shù)量的減少是影響心血管功能和促進(jìn)心血管疾病發(fā)生的重要因素。

在骨折修復(fù)與再生方面，Matsumoto等［15］認(rèn)為CD34+的EPCs和造血干細(xì)胞都是細(xì)胞系的不同分化階段，如MSCs一樣，CD34+的EPCs和造血干細(xì)胞在體內(nèi)都可以向成骨方向分化［16，17］。骨折的不愈合或延遲愈合很大程度上與骨膜或者骨折附近血供被破壞有關(guān)，由于EPCs具有很強(qiáng)的成血管的能力，同時(shí)還可以通過旁分泌VEGF促進(jìn)毛細(xì)血管形成，EPCs若能向成骨方向分化，對(duì)骨折的治療將會(huì)有非常好的應(yīng)用前景。

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