大鼠物體識別實驗裝置的研制

宋廣青，高 莉，孫秀萍，王 逸，武宏偉，李海清，劉新民

(1．中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所藥理毒理中心，北京 100193;2．新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所，烏魯木齊830049;3．中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，北京 100021;4．北京鑫海華儀科技有限公司，北京 100193)

物體識別實驗(object recognition task，ORT)［1］是一種精細、敏感的行為學(xué)檢測方法，以其獨特的優(yōu)勢近年來得到了廣泛的應(yīng)用。該實驗方法利用嚙齒類動物天生喜歡接近和探索新奇物體的本性［2］為原理，即當(dāng)一個新奇物體和一個先前遇到過的物體同時出現(xiàn)時，嚙齒類動物會花費更多的時間對新奇物體進行探索;無需給實驗動物食物誘導(dǎo)或不利刺激［3］。物體識別實驗是一種一次性的學(xué)習(xí)實驗?zāi)Ｊ剑芯空呖梢詫τ洃浀牧?xí)得、鞏固和消退［4，5］階段分別進行精細化研究。物體識別實驗被廣泛用于記憶神經(jīng)生物學(xué)研究、腦損傷機制研究［6］以及認知障礙防護措施研究［7，8］等多個方面。

近年來，物體識別實驗被國際科學(xué)界作為一種對動物學(xué)習(xí)記憶、益智藥效研究和記憶機制研究的新方法而受到廣泛應(yīng)用和重視。目前，用于物體識別實驗的裝置基本上都是直接暴露于外界環(huán)境中，不能避免外界干擾對動物行為的影響。為了更好的模擬自然環(huán)境提高實驗結(jié)果的準確性，我們實驗室在傳統(tǒng)檢測裝置的基礎(chǔ)上對大鼠物體識別實驗裝置進行了改進。本文主要介紹了新研制的大鼠物體識別實驗裝置，并對新裝置的可行性進行了部分驗證。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 測試裝置所需材料:計算機(Pentium 2.4 GHz，內(nèi)存:1 G，硬盤:80 G，顯卡:Geforce 4 MX 440);I/O卡;Visual C++可視化軟件開發(fā)工具(微軟公司);復(fù)雜可編程邏輯器件(CPLD，Xilinx公司)，接口芯片(PLX公司);LED燈;彩色攝像頭;金屬材料、PVC材料、磁鐵;電路板;數(shù)字式照度計［TES-1330A］。

1.1.2 實驗動物:SPF級Wistar大鼠，雄性，6周齡和10周齡，體重(230±10)g和(340±10)g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2012-0001】。動物充足的食、水，進行適宜性喂養(yǎng)，實驗室安靜，溫度24°C，12 h照明/12 h黑暗環(huán)境(8:a．m．開燈)。動物實驗遵守國際實驗動物倫理學(xué)要求。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠物體識別實驗裝置的研制:參考綜述文獻［3］和相關(guān)學(xué)科技術(shù)，設(shè)計大鼠物體識別實時監(jiān)測裝置和物體。封閉測試箱整體尺寸:長60 cm、寬40 cm、高80 cm。物體:(1)橘紅色鐵制圓柱體(底徑5 cm，高10 cm);(2)橘紅色鐵制三角錐體(底邊5c m，高10 cm);(3)藍色鐵制圓柱體(底徑5 cm，高10 cm);(4)藍色鐵制三角錐體(底邊5 cm，高10 cm)，每套物體有3個/每個測試箱。

大鼠物體識別實驗裝置設(shè)計見圖1。(所用傳統(tǒng)裝置的測試箱是一個礦場裝置，測試箱整體尺寸:長60 cm、寬40 cm、高40 cm，攝像頭以一定距離懸于上方，材料與封閉裝置完全相同，由實驗室頂部燈管提供光照)

大鼠物體識別實驗封閉裝置測試箱體兩側(cè)中間位置裝有兩排LED燈，箱體內(nèi)光強度可人為進行調(diào)節(jié);箱體頂部裝有一彩色攝像頭;箱體內(nèi)部使用黑色PVC材料，箱底板噴以黑色啞光漆并用砂紙打磨以避免反光，在距離側(cè)壁10 cm對稱位置處裝有磁鐵用于固定兩個物體，底板可抽出便于清洗動物殘屑物。計算機可對測試箱內(nèi)部進行實時監(jiān)測。大鼠物體識別實驗封閉裝置及物體見圖2。

1.2.2 動物分組:將大鼠隨機分為:敞口組、(230±10)g組(封閉組)、(340±10)g組。

圖1 大鼠物體識別實驗裝置設(shè)計示意圖Fig．1 Diagram of the apparatus for object recognition task in rats

圖2 大鼠物體識別實驗裝置實物圖Fig．2 The apparatus for object recognition task in rats

1.2.3 物體識別實驗程序的建立:選用一個測試箱(封閉或敞口)進行實驗，用于實驗的兩套物體:橘紅色鐵制圓柱體、橘紅色鐵制三角錐體，調(diào)節(jié)測試箱內(nèi)光強度為30～40 Lux。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，開始連續(xù)2 d的抓、摸適應(yīng)過程，實驗人員每天用手抓、摸大鼠尾部及身體約3 min/只。適應(yīng)期:第6天將大鼠依次放入沒有任何物體的測試箱中讓其自由活動3 min，連續(xù)2次。檢測實驗:檢測實驗發(fā)生在適應(yīng)期的第2天，包括2個階段-熟悉期和測試期，每一階段實驗時間5 min，檢測實驗進行前將大鼠依次放入測試箱中再次適應(yīng)，3 min/只，以便使測試箱中浸滿氣味;熟悉期時在測試箱內(nèi)底板上距離側(cè)壁10 cm的磁鐵處放入兩個相同的物體，將大鼠以背對物體的方式放入測試箱中，待實驗結(jié)束時將大鼠重新放入飼養(yǎng)籠;間隔1 h后進入測試期，測試期時在測試箱內(nèi)放入兩個不同的物體(一個與熟悉期物體完全相同稱為“熟悉物體”，另一個不同的物體稱為“新奇物體”)。物體的使用(熟悉物體或者新奇物體)在實驗動物中要平衡，即一半的動物以圓柱體作為熟悉物體，另一半的動物以三角錐體作為熟悉物體;測試期兩個物體的位置要隨機置換。熟悉期和測試期時，動物對兩個物體的探索時間分別由同一實驗員通過計算機屏幕用兩個秒表記錄。每只動物實驗結(jié)束時用紙將其殘泄物擦拭干凈再開始下一只動物實驗，避免大鼠在實驗時被物體之外的東西吸引而影響實驗結(jié)果，每天實驗結(jié)束后用蘸有70%酒精的棉球擦拭底板和物體［7］。

大鼠對物體的探索活動定義為:大鼠的鼻子在≤2 cm的范圍指向物體或者用口鼻部直接嗅、舔物體。當(dāng)大鼠坐在物體上或身體其他部位接觸物體而鼻子沒有指向物體時都不被認為是對物體的探索活動。

物體識別實驗中用于表示物體探索和辨別的相關(guān)指標見表1:

表1 物體識別實驗中用于表示物體探索和辨別的實驗指標Tab．1 Exploration measures used to indicate the performance in the object recognition task

物體識別實驗中最基本的指標是動物在熟悉期和測試期對兩個物體的探索時間(s)。熟悉期時動物對兩個相同物體的探索時間分別用Tf1、Tf2表示，測試期時動物對熟悉物體和新奇物體的探索時間分別用Tf和Tn表示。由這些探索時間，可以推導(dǎo)出以下指標:e1=Tf1+Tf2，e2=Tf+Tn，d1=Tn–Tf和d2=d1/e2(表1)。e1和e2分別表示熟悉期和測試期時大鼠對兩個物體的探索總時間。d1和d2被當(dāng)做是辨別出熟悉物體和新奇物體的指標。d2是一個相對辨別指標，考慮到了動物之間不同的探索活動水平。d2的范圍是－1～1，－1表示動物在測試期時完全偏愛熟悉物體，0表示動物在測試期時對熟悉物體和新奇物體的探索時間相同無物體偏愛性，1表示動物在測試期時完全偏愛新奇物體。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件 SPSS 16.0進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤(ˉ±s)表示。組內(nèi)評價Tf和Tn是否不同用配對t檢驗(paired-samples t test)進行分析。組間比較 e1、e2、d1和d2用獨立樣本 t檢驗(independent-sample t test)。另外，用單樣本t檢驗(one-sample t test)比較每組d2與0的顯著性，當(dāng)存在差異顯著性時表示該組動物在測試期實驗時能夠辨別出熟悉物體。以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 封閉和敞口裝置中大鼠物體識別實驗結(jié)果的比較

2.1.1 每組大鼠物體辨別能力:圖3顯示兩組大鼠測試期時(間隔1 h)對新奇物體探索時間(Tn)顯著高于對熟悉物體探索時間(Tf)(P＜0.01，P＜0.05)。相對辨別指數(shù)d2與0比較時只有封閉組有顯著性差異(P＜0.01)。

2.1.2 兩組大鼠探索水平和物體辨別能力的比較:圖4顯示封閉組和敞口組大鼠測試期探索總時間(e2)差異存在顯著性(P＜0.05);封閉組相對辨別指數(shù)d1與敞口組相比差異存在顯著性 (P＜0.05)。兩組熟悉期探索總時間(e1)之間及絕對辨別指數(shù)d2之間比較差異無顯著性。

2.2 兩種常用體重正常大鼠在封閉裝置中進行物體識別實驗結(jié)果的比較

2.2.1 每組大鼠物體辨別能力:圖5顯示 在封閉裝置中兩種不同體重大鼠測試期時(間隔1 h)對新奇物體探索時間(Tn)都顯著高于對熟悉物體探索時間(Tf)(P＜0.01)。相對辨別指數(shù)d2與0比較，兩組差異都具有顯著性 (P＜0.01，P＜0.05)。

2.2.2 兩組大鼠探索水平和物體辨別能力的比較:圖6顯示(230±10)g組熟悉期探索總時間(e1)顯著高于(340±10)g組(P＜0.01);(230±10)g組相對辨別指數(shù)d1與(340±10)g組相比差異存在顯著性(P＜0.01)。兩組測試期探索總時間(e2)之間及絕對辨別指數(shù)d2之間比較差異無顯著性。

圖3 封閉組和敞口組大鼠的物體辨別能力Fig．3 Object recognition ability of the rats tested with the closed apparatus or open-field apparatus

圖4 封閉和敞口裝置中大鼠探索時間及相對辨別指數(shù)的比較Fig．4 Comparison of the exploration time and absolute discrimination index d1，respectively，between the closed and open-field groups

圖5 230±10 g和340±10 g兩組大鼠各自的物體辨別能力Fig．5 Object recognition ability of the 230±10 g and 340±10 g rats

圖6 兩組不同體重大鼠探索時間及相對辨別指數(shù)的比較Fig．6 Comparison of the exploration time and absolute discrimination index d1，respectively，between the 230 ±10 g and 340 ±10 g rats

3 討論

物體識別實驗主要用于檢測哺乳動物的陳述性記憶［9］，自 1988 年被 Ennaceur和 Delacour提出后就得到了廣泛的應(yīng)用。較其他記憶檢測任務(wù)，該實驗方法具有很多優(yōu)勢，如只需要較少的訓(xùn)練，引起的應(yīng)激及情緒激發(fā)較?。?0］。另外，物體識別不但可以用于檢測動物的非空間記憶能力還可用其他多種模式對動物的空間記憶能力、物體背景信息和物體順序等進行檢測，實現(xiàn)精細化研究。因此，物體識別將在動物行為學(xué)研究中日益重要。

物體識別實驗程序簡單明確易操作，便于該方法在不同實驗室中的建立。盡管物體識別實驗在嚙齒類動物中得到了廣泛應(yīng)用，但是在該方法實施過程中不同實驗室有各自的版本。目前，進行大鼠物體識別實驗的裝置都是不同尺寸或不同材質(zhì)的矩形或方形的實驗箱［3］，少數(shù)是圓形或Y型實驗箱［10－12］，這些傳統(tǒng)的實驗裝置都是敞口的，直接暴露于外界環(huán)境中，不能避免外界因素對實驗的影響。我們實驗室以傳統(tǒng)敞口裝置為基礎(chǔ)參考相關(guān)文獻并結(jié)合機械工程和實驗動物行為學(xué)技術(shù)，對大鼠物體識別實驗裝置進行了改進，研制出新的封閉的物體識別實驗裝置。該套裝置有四個實驗箱和計算機系統(tǒng)組成，每個實驗箱都是一個獨立的封閉環(huán)境，這是該套裝置最大的特點。封閉裝置能夠模擬自然環(huán)境從而避免了外部因素對實驗的干擾，并且封閉裝置方便實現(xiàn)光照條件的穩(wěn)定和均一，特別利于今后自動化分析處理系統(tǒng)的實現(xiàn)。

本文從兩個方面對新裝置的可行性進行驗證，首先用正常Wistar雄性大鼠分別在傳統(tǒng)開口裝置和新研制封閉裝置中進行物體識別實驗，對兩種環(huán)境下大鼠的辨別能力和探索水平進行比較。在封閉裝置中，正常雄性Wistar大鼠對新奇物體的探索時間明顯多于對熟悉物體的探索時間，并且d2也大于0，說明正常動物能夠辨別出熟悉期物體表現(xiàn)出正常的識別記憶能力，并且封閉組和敞口組的相對辨別指數(shù)之間沒有差異，說明新研制的封閉裝置和傳統(tǒng)的敞口裝置一樣都能夠進行大鼠物體識別實驗。敞口組大鼠雖然對新奇物體和熟悉物體的探索時間有明顯差異，但是d2與0比較沒有差異，且測試期探索時間明顯少于封閉組，兩組的絕對辨別指數(shù)也明顯不同，說明敞口環(huán)境下正常大鼠的探索水平受到一定程度的限制。這一結(jié)果與使用大的礦場裝置能增加探索水平的報道不一致［3］，可能是外部聲音、光線等因素影響了正常大鼠的探索水平，導(dǎo)致個別動物測試期時對物體的探索總時間少而對熟悉物體的探索時間卻遠大于對新奇物體的探索時間或不探索任何物體的情況出現(xiàn)，在數(shù)據(jù)處理時需要剔除測試期對物體沒有進行探索的大鼠，降低了樣本量。在封閉裝置中，大鼠不同個體對物體的探索時間較均一，出現(xiàn)極端情況的可能性較小，使得辨別指數(shù)的可靠性增加，而且對實驗條件(燈光、聲音等)的可控性方面更具優(yōu)勢。一般選用200 g或300 g左右成年雄性Wistar大鼠進行物體識別實驗研究或藥效學(xué)研究［13－17］，本實驗選擇230±10 g和340±10 g正常雄性Wistar大鼠作為實驗動物，進行物體識別實驗對新裝置的可行性再次進行驗證。選用Wistar大鼠是基于正常情況下在間隔1 h時，該種大鼠能夠表現(xiàn)出很好的辨別能力［18］，而選擇雄性大鼠是考慮到實驗室初步建立該檢測方法盡量減少方法本身之外的其他因素的影響，因為有研究表明雌性大鼠進行物體識別實驗的結(jié)果受其生理周期的影響［13，17］。在新研制的封閉裝置中，兩組大鼠都能夠辨別出物體，表明對熟悉物體有記憶，并且兩組之間的相對辨別指數(shù)沒有明顯差異，進一步說明新研制的實時監(jiān)測裝置能夠進行物體識別實驗。兩組大鼠熟悉期探索時間、絕對辨別指數(shù)都明顯不同，說明在此裝置中物體識別實驗?zāi)軌蛎舾械臋z測出兩種不同體重大鼠探索水平的差異。

本文主要介紹了新研制的大鼠物體識別實驗裝置，并從兩個方面對其可行性進行了驗證，在初步建立物體識別實驗方法的基礎(chǔ)上，研制了一種穩(wěn)定、可靠的用于檢測大鼠識別記憶的行為學(xué)實時監(jiān)測裝置，并為今后物體識別自動化、智能化的實現(xiàn)提供科學(xué)依據(jù)。

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