關節(jié)腔內注射高烏甲素對兔膝骨性關節(jié)炎的影響

于 娟，李莎莎，葉瑩儀，葛鴻慶，陳文治，鄧曉強，余宇峰

(廣東省中醫(yī)院，廣州 510120)

骨關節(jié)炎是一種慢性退行性關節(jié)疾病，從關節(jié)軟骨退化開始，繼而發(fā)生骨質和滑膜改變的關節(jié)疾病，在其防治方面尚無針對性的特效藥物。目前據流行病學統(tǒng)計，我國成年人中膝骨關節(jié)炎的患病率為2.2%～9.6% ，而60歲以上老年人中，此病的患病率則高達49%［1］。近年來，炎癥細胞因子與骨關節(jié)炎的關系日益受到重視，有研究表明 IL-1、MMP-2是參與骨關節(jié)炎進程的重要介質［2］。高烏甲素別名拉巴烏頭堿或刺烏頭堿，是一種非成癮性鎮(zhèn)痛藥，具有局部麻醉、降溫、解熱和抗炎消腫作用［3］，高烏甲素在臨床應用中對膝骨性關節(jié)炎的療效已經被證實［4，5］，其治療機制尚不明確。本實驗通過觀察高烏甲素對兔膝0A模型軟骨細胞形態(tài)結構及血清和關節(jié)液中炎癥細胞因子的改變，探討關節(jié)軟骨結構的改變和炎癥細胞因子的表達與關節(jié)炎發(fā)病可能的相關規(guī)律以及高烏甲素對關節(jié)炎的治療作用及可能的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

普通級新西蘭兔42只，雄性，體重(2.0～2.5)kg，質 量 合 格 證 號 0039854、0115216、0113398、0115213 0114105、0114265、4407207637，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心［生產許可證號:SCXK(粵)2008-0002］，花都花東信華實驗動物養(yǎng)殖場［生產許可證號:SCXK(粵)2009-0023］提供。動物實驗環(huán)境設施為廣東省中醫(yī)院動物實驗中心［使用許可證號:SYXK(粵)2008-0094］。

1.2 試劑

注射用氫溴酸高烏甲素凍干粉劑:4 mg/瓶，購于山東羅欣藥業(yè)股份有限公司。兔IL-1β、兔MMP-2、酶聯免疫分析試劑盒均購置于武漢華美生物制品有限公司(批號J12011870、D19011871)。

1.3 動物模型的建立及分組

新西蘭兔采用Hulth法構建膝骨關節(jié)炎模型［6］。術前禁食 6 h，3% 戊巴比妥鈉 i．p．(0.9 mL/kg)麻醉，選取右側后肢內側，先與髕韌帶平行，縱行向下，至關節(jié)間隙下約0.5 cm處弧形向后，再與關節(jié)間隙平行，延伸至關節(jié)間隙后部，沿關節(jié)囊纖維走向切開關節(jié)囊，向外側推離髕骨造成脫位。依次進入兔膝關節(jié)，屈曲膝關節(jié)，直視下可見膝交叉韌帶，用眼科剪剪斷前后交叉韌帶并切除內側半月板，避免損傷關節(jié)面軟骨。行前后抽屜實驗證實交叉韌帶完全切斷，生理鹽水清潔關節(jié)腔積血、積屑、逐層縫合傷口，無菌包扎固定。術后所有動物每天驅趕上午、下午各強制運動30 min。術后4周隨機抽取6只兔膝關節(jié)顯微鏡下觀察，確定造模成功后，分為補腎活血法高烏甲素組、模型組，每組再按給藥4、6、8周后3個時間點分配，每個點6只。

1.4 給藥方法

高烏甲素4 mg用注射用水2 mL稀釋，高烏甲素高烏甲素組造模后4周開始給藥，關節(jié)腔內注射0.5 mL/次/只/周，共4周，模型組予同樣劑量的生理鹽水。

1.5 觀察指標及方法

1.5.1 HE染色 取股骨內側髁約(0.5×0.5×0.2)cm組織塊標本，4%甲醛溶液固定，脫鈣，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片。蘇木素伊紅染色，樹膠封片，光鏡下觀察［7］。HE染色按 Mankin's評分標準進行。

1.5.2 Elisa法檢測 于藥物治療4周、6周、8周后處死動物，通過兔耳緣靜脈取血，分離血清、－20℃凍存;膝關節(jié)進行關節(jié)液的采集，取樣部位消毒，切開右膝關節(jié)囊，用0.5 mL生理鹽水沖洗關節(jié)腔收集關節(jié)液，離心收集上清液 －20℃保存，待測［8］。待所有標本收集完成后，用酶聯免疫吸附測定法(ELISA)檢測 IL-β、MMP-2的含量，步驟按說明書進行。

1.6 統(tǒng)計分析

2 結果

2.1 石蠟切片、HE染色結果

如圖1(見封三)所示，同時期模型組軟骨細胞數目多于高烏甲素組。模型組給予生理鹽水4周后軟骨細胞排列接近正常，軟骨面較平整，6周后，HE染色不均勻，特別是表層染色減退，但潮線完整，8周后軟骨表面出現裂隙，軟骨細胞數量增多，結構不均勻。軟骨細胞簇集，軟骨破壞較重的關節(jié)面可見表層軟骨變薄，有較多的血管增生。高烏甲素組給藥4周后軟骨細胞排列與模型組無明顯差異，6周后，HE染色均勻，潮線完整，8周后軟骨面糜爛明顯減輕，軟骨表面無明顯裂隙，結構完整，軟骨細胞數量增多，無明顯簇集，軟骨細胞血管增生明顯。

2.2 Mankin's評分結果

如圖2所示，治療4周后模型組與高烏甲素組評分無明顯差異，6周后，高烏甲素組較模型組比較，有顯著性差異(P＜0.01)，至8周后，差異更明顯(P＜0.001)，提示高烏甲素對于骨性關節(jié)炎的修復，可能通過促進細胞的自我修復來實現的。

圖2軟骨組織切片Mankin's評分結果(，n=6)Fig．2 Mankin's score of the cartilage histology

2.3 IL-1β、MMP-2濃度檢測結果

2.3.1 血清IL-1β濃度:如圖3所示，結果表明，組內前后比較，在治療4周后，IL-1β表達明顯增加，提示手術后炎癥反應強烈，隨著時間的延長，模型組IL-1β逐漸降低，提示炎癥逐漸減弱，由急性炎癥反應轉變?yōu)槁匝装Y反應。給予高烏甲素治療，無顯著性差異。組間同期比較，差異均無顯著性。提示高烏甲素對血清IL-1β影響較弱。綜上分析，高烏甲素抑制 IL-1β的表達對全身炎癥反應影響不大。

2.3.2 關節(jié)液MMP-2濃度:如圖4所示，模型組在治療四周后即升高，隨著時間的延長，關節(jié)液MMP-2呈逐漸降低的趨勢。組內前后比較，在給藥4周后，高烏甲素即能顯著降低MMP-2的表達(P＜0.05)，隨著時間的延長，至6后，高烏甲素組MMP-2降低更加明顯(P＜0.01)。綜上分析，高烏甲素能夠在兔關節(jié)滑膜內顯著抑制MMP-2的表達，提示高烏甲素治療的有效性。

圖3血清IL-1β濃度(pg/mL，ˉ±s，n=6)Fig．3 The concentration of serum IL-1β(pg/mL，ˉ±s，n=6)

圖4關節(jié)液MMP-2濃度(ng/mL，，n=6)Compared with the model group，＊＊P ＜0.01．Fig．4 The concentration of MMP-2(ng/mL in the joint fluid，，n=6)

3 討論

膝骨性關節(jié)炎是影響人類健康最常見的關節(jié)疾患之一，其發(fā)病機制尚不十分清楚，但炎癥細胞因子的參與已經獲得認同。IL-1β是一種激素樣多肽，在改變軟骨細胞正常結構和功能，促進軟骨細胞凋亡發(fā)生，降解軟骨細胞基質等方面均發(fā)揮作用［9］。MMPs家族能夠降解關節(jié)組織細胞外基質的所有成分，研究證實各種炎癥性因子可增加基質金屬蛋白酶的活性，從而造成關節(jié)軟骨的損傷［10］。因此IL-1、MMPs的協(xié)同效應在膝骨性關節(jié)炎的發(fā)病機制中起著非常重要的作用。有研究表明，使用Hulth手術造模法建立的膝骨性關節(jié)炎模型在術后4周與人類的早期膝關節(jié)炎，特別是創(chuàng)傷后(如半月板損傷、交叉韌帶損傷等)的膝骨性關節(jié)炎在病理、形態(tài)學等方面極為相似［11，12］。

本實驗中，采用Hulth法復制關節(jié)炎模型，以探討高烏甲素在治療膝骨性關節(jié)炎方面可能的機制。結果顯示，在高烏甲素的早期治療下，病變組織得到修復，在關節(jié)炎發(fā)病的早期，高烏甲素作用于血清中MMP-2，給藥4周后MMP-2濃度明顯降低，6周后更低，說明藥物作用時間有所延長并且有持續(xù)性增強作用，說明高烏甲素可以通過長時間調控MMP-2濃度以降低軟骨基質的降解，從而減緩炎癥的行程，盡管高烏甲素對IL-1β的調節(jié)在統(tǒng)計學上差異沒有顯著性，但從結果可以看出，給藥4周后高烏甲素組的濃度是低于模型組的，而停止給藥后出現反彈，但與模型組比較差異不顯著，這也更進一步說明高烏甲素對IL-1β的調控作用時間具有即時性。在給藥6周后，高烏甲素對關節(jié)液MMP-2的表達的顯著降低作用提示高烏甲素的局部治療作用。但在關節(jié)炎晚期，高烏甲素的治療作用不顯著，綜上所述，高烏甲素治療關節(jié)炎需在早期才能達到好的療效。本實驗結果中高烏甲素雖然不能在關節(jié)炎發(fā)病的任何時期對IL-1β、MMP-2的表達有顯著作用，卻也證實了關節(jié)炎的發(fā)病機制與這二種因子的異常表達有關，這與前人研究結論相一致。結合病理切片和炎癥細胞因子濃度檢測結果推斷，關節(jié)軟骨的自我修復也起到重要作用，提示高烏甲素早期治療可能是通過調控炎癥細胞因子的表達，促進關節(jié)軟骨的自我修復能力而達到治療作用的。此外，由于Hulth造模法復制的模型易造成關節(jié)通路手術創(chuàng)傷及炎癥且病變限制于內側室［13］，提示高烏甲素直接作用于病灶的治療方法的有效性。為高烏甲素臨床治療膝骨性關節(jié)炎提供了理論依據。

［1］ 張乃崢，施金勝，張雪哲，等．膝骨關節(jié)炎的流行病學調查［J］．中華內科雜志，1995，34(2):84．

［2］ 宋震坤，陳文照．環(huán)氧化酶-2與關節(jié)炎［J］．中國骨傷，2003，16(5):315．

［3］ Easter A．Management of patients with multiple rib fractures［J］．Am J Critical Care，2001，10(5):320．

［4］ 鄔強鄒越彬．中藥合氫溴酸高烏甲素片治療膝骨關節(jié)炎52例［J］．陜西中醫(yī)，2006，5(9):522．

［5］ 鄧芳．高烏甲素關節(jié)腔阻滯治療膝關節(jié)骨性關節(jié)炎的療效觀察［J］．浙江臨床醫(yī)學，2003，5(12):928．

［6］ 胡阿威，張磊，張功禮，等．改良Hulth法骨關節(jié)炎動物模型的建立［J］．中華醫(yī)學叢刊，2003，3(9):5．

［7］ 周軍，劉曉海，宋亞玲，等．抗骨增生膠囊對大鼠骨性關節(jié)炎的實驗研究 ［J］．中國實驗方劑學雜志，2012，18(19):145．

［8］ 王桂芳，石宇，張金超．蟻龍通痹湯改善兔膝骨關節(jié)炎軟骨組織骨生物力學的炎癥機制［J］．中國實驗方劑學雜志，2012，18(15):218．

［9］ Mathieu P．Interleukin l:Its role，its dosage，the difficulties in advances in arthritis．Results of a“Pilot”study with diacerheine(AR50)in gonarthrosis［J］．Rev Prat，1999，Suppl 13:S15 －18．

［10］ Freemont AJ，Byers RJ，Taiwo YO，et al．Resurfacing of articular cartilage by genetically-modified human chondrocytes in vitro［J］．Ann Rheum Dis，1999，58(23):673．

［11］ 袁琴，闞衛(wèi)兵，宋朋飛，等．中醫(yī)藥治療骨關節(jié)炎基礎研究進展［J］．遼寧中醫(yī)藥大學學報，2012，14(1):101．

［12］ 翟云，高根德，徐守宇．膝關節(jié)骨關節(jié)炎的基礎研究進展［J］．中國骨傷，2012，28(1):83．

［13］ Han S，Seerattan R，He～og W．Mechanical loading of in situ chondrocytes in lapine retropatellar cartilage after anterior cruciate ligament transection［J］．J R Soc Interface，2010，7(47):895．