關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射高烏甲素對(duì)兔膝骨性關(guān)節(jié)炎的影響

于 娟，李莎莎，葉瑩儀，葛鴻慶，陳文治，鄧曉強(qiáng)，余宇峰

(廣東省中醫(yī)院，廣州 510120)

骨關(guān)節(jié)炎是一種慢性退行性關(guān)節(jié)疾病，從關(guān)節(jié)軟骨退化開始，繼而發(fā)生骨質(zhì)和滑膜改變的關(guān)節(jié)疾病，在其防治方面尚無針對(duì)性的特效藥物。目前據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)成年人中膝骨關(guān)節(jié)炎的患病率為2.2%～9.6% ，而60歲以上老年人中，此病的患病率則高達(dá)49%［1］。近年來，炎癥細(xì)胞因子與骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)系日益受到重視，有研究表明 IL-1、MMP-2是參與骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)程的重要介質(zhì)［2］。高烏甲素別名拉巴烏頭堿或刺烏頭堿，是一種非成癮性鎮(zhèn)痛藥，具有局部麻醉、降溫、解熱和抗炎消腫作用［3］，高烏甲素在臨床應(yīng)用中對(duì)膝骨性關(guān)節(jié)炎的療效已經(jīng)被證實(shí)［4，5］，其治療機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過觀察高烏甲素對(duì)兔膝0A模型軟骨細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及血清和關(guān)節(jié)液中炎癥細(xì)胞因子的改變，探討關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)的改變和炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)與關(guān)節(jié)炎發(fā)病可能的相關(guān)規(guī)律以及高烏甲素對(duì)關(guān)節(jié)炎的治療作用及可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通級(jí)新西蘭兔42只，雄性，體重(2.0～2.5)kg，質(zhì) 量 合 格 證 號(hào) 0039854、0115216、0113398、0115213 0114105、0114265、4407207637，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(粵)2008-0002］，花都花東信華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)［生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(粵)2009-0023］提供。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)環(huán)境設(shè)施為廣東省中醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心［使用許可證號(hào):SYXK(粵)2008-0094］。

1.2 試劑

注射用氫溴酸高烏甲素凍干粉劑:4 mg/瓶，購于山東羅欣藥業(yè)股份有限公司。兔IL-1β、兔MMP-2、酶聯(lián)免疫分析試劑盒均購置于武漢華美生物制品有限公司(批號(hào)J12011870、D19011871)。

1.3 動(dòng)物模型的建立及分組

新西蘭兔采用Hulth法構(gòu)建膝骨關(guān)節(jié)炎模型［6］。術(shù)前禁食 6 h，3% 戊巴比妥鈉 i．p．(0.9 mL/kg)麻醉，選取右側(cè)后肢內(nèi)側(cè)，先與髕韌帶平行，縱行向下，至關(guān)節(jié)間隙下約0.5 cm處弧形向后，再與關(guān)節(jié)間隙平行，延伸至關(guān)節(jié)間隙后部，沿關(guān)節(jié)囊纖維走向切開關(guān)節(jié)囊，向外側(cè)推離髕骨造成脫位。依次進(jìn)入兔膝關(guān)節(jié)，屈曲膝關(guān)節(jié)，直視下可見膝交叉韌帶，用眼科剪剪斷前后交叉韌帶并切除內(nèi)側(cè)半月板，避免損傷關(guān)節(jié)面軟骨。行前后抽屜實(shí)驗(yàn)證實(shí)交叉韌帶完全切斷，生理鹽水清潔關(guān)節(jié)腔積血、積屑、逐層縫合傷口，無菌包扎固定。術(shù)后所有動(dòng)物每天驅(qū)趕上午、下午各強(qiáng)制運(yùn)動(dòng)30 min。術(shù)后4周隨機(jī)抽取6只兔膝關(guān)節(jié)顯微鏡下觀察，確定造模成功后，分為補(bǔ)腎活血法高烏甲素組、模型組，每組再按給藥4、6、8周后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)分配，每個(gè)點(diǎn)6只。

1.4 給藥方法

高烏甲素4 mg用注射用水2 mL稀釋，高烏甲素高烏甲素組造模后4周開始給藥，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射0.5 mL/次/只/周，共4周，模型組予同樣劑量的生理鹽水。

1.5 觀察指標(biāo)及方法

1.5.1 HE染色 取股骨內(nèi)側(cè)髁約(0.5×0.5×0.2)cm組織塊標(biāo)本，4%甲醛溶液固定，脫鈣，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片。蘇木素伊紅染色，樹膠封片，光鏡下觀察［7］。HE染色按 Mankin's評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.5.2 Elisa法檢測(cè) 于藥物治療4周、6周、8周后處死動(dòng)物，通過兔耳緣靜脈取血，分離血清、－20℃凍存;膝關(guān)節(jié)進(jìn)行關(guān)節(jié)液的采集，取樣部位消毒，切開右膝關(guān)節(jié)囊，用0.5 mL生理鹽水沖洗關(guān)節(jié)腔收集關(guān)節(jié)液，離心收集上清液 －20℃保存，待測(cè)［8］。待所有標(biāo)本收集完成后，用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)檢測(cè) IL-β、MMP-2的含量，步驟按說明書進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 石蠟切片、HE染色結(jié)果

如圖1(見封三)所示，同時(shí)期模型組軟骨細(xì)胞數(shù)目多于高烏甲素組。模型組給予生理鹽水4周后軟骨細(xì)胞排列接近正常，軟骨面較平整，6周后，HE染色不均勻，特別是表層染色減退，但潮線完整，8周后軟骨表面出現(xiàn)裂隙，軟骨細(xì)胞數(shù)量增多，結(jié)構(gòu)不均勻。軟骨細(xì)胞簇集，軟骨破壞較重的關(guān)節(jié)面可見表層軟骨變薄，有較多的血管增生。高烏甲素組給藥4周后軟骨細(xì)胞排列與模型組無明顯差異，6周后，HE染色均勻，潮線完整，8周后軟骨面糜爛明顯減輕，軟骨表面無明顯裂隙，結(jié)構(gòu)完整，軟骨細(xì)胞數(shù)量增多，無明顯簇集，軟骨細(xì)胞血管增生明顯。

2.2 Mankin's評(píng)分結(jié)果

如圖2所示，治療4周后模型組與高烏甲素組評(píng)分無明顯差異，6周后，高烏甲素組較模型組比較，有顯著性差異(P＜0.01)，至8周后，差異更明顯(P＜0.001)，提示高烏甲素對(duì)于骨性關(guān)節(jié)炎的修復(fù)，可能通過促進(jìn)細(xì)胞的自我修復(fù)來實(shí)現(xiàn)的。

圖2軟骨組織切片Mankin's評(píng)分結(jié)果(，n=6)Fig．2 Mankin's score of the cartilage histology

2.3 IL-1β、MMP-2濃度檢測(cè)結(jié)果

2.3.1 血清IL-1β濃度:如圖3所示，結(jié)果表明，組內(nèi)前后比較，在治療4周后，IL-1β表達(dá)明顯增加，提示手術(shù)后炎癥反應(yīng)強(qiáng)烈，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，模型組IL-1β逐漸降低，提示炎癥逐漸減弱，由急性炎癥反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)槁匝装Y反應(yīng)。給予高烏甲素治療，無顯著性差異。組間同期比較，差異均無顯著性。提示高烏甲素對(duì)血清IL-1β影響較弱。綜上分析，高烏甲素抑制 IL-1β的表達(dá)對(duì)全身炎癥反應(yīng)影響不大。

2.3.2 關(guān)節(jié)液MMP-2濃度:如圖4所示，模型組在治療四周后即升高，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，關(guān)節(jié)液MMP-2呈逐漸降低的趨勢(shì)。組內(nèi)前后比較，在給藥4周后，高烏甲素即能顯著降低MMP-2的表達(dá)(P＜0.05)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，至6后，高烏甲素組MMP-2降低更加明顯(P＜0.01)。綜上分析，高烏甲素能夠在兔關(guān)節(jié)滑膜內(nèi)顯著抑制MMP-2的表達(dá)，提示高烏甲素治療的有效性。

圖3血清IL-1β濃度(pg/mL，ˉ±s，n=6)Fig．3 The concentration of serum IL-1β(pg/mL，ˉ±s，n=6)

圖4關(guān)節(jié)液MMP-2濃度(ng/mL，，n=6)Compared with the model group，＊＊P ＜0.01．Fig．4 The concentration of MMP-2(ng/mL in the joint fluid，，n=6)

3 討論

膝骨性關(guān)節(jié)炎是影響人類健康最常見的關(guān)節(jié)疾患之一，其發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，但炎癥細(xì)胞因子的參與已經(jīng)獲得認(rèn)同。IL-1β是一種激素樣多肽，在改變軟骨細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)和功能，促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡發(fā)生，降解軟骨細(xì)胞基質(zhì)等方面均發(fā)揮作用［9］。MMPs家族能夠降解關(guān)節(jié)組織細(xì)胞外基質(zhì)的所有成分，研究證實(shí)各種炎癥性因子可增加基質(zhì)金屬蛋白酶的活性，從而造成關(guān)節(jié)軟骨的損傷［10］。因此IL-1、MMPs的協(xié)同效應(yīng)在膝骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制中起著非常重要的作用。有研究表明，使用Hulth手術(shù)造模法建立的膝骨性關(guān)節(jié)炎模型在術(shù)后4周與人類的早期膝關(guān)節(jié)炎，特別是創(chuàng)傷后(如半月板損傷、交叉韌帶損傷等)的膝骨性關(guān)節(jié)炎在病理、形態(tài)學(xué)等方面極為相似［11，12］。

本實(shí)驗(yàn)中，采用Hulth法復(fù)制關(guān)節(jié)炎模型，以探討高烏甲素在治療膝骨性關(guān)節(jié)炎方面可能的機(jī)制。結(jié)果顯示，在高烏甲素的早期治療下，病變組織得到修復(fù)，在關(guān)節(jié)炎發(fā)病的早期，高烏甲素作用于血清中MMP-2，給藥4周后MMP-2濃度明顯降低，6周后更低，說明藥物作用時(shí)間有所延長(zhǎng)并且有持續(xù)性增強(qiáng)作用，說明高烏甲素可以通過長(zhǎng)時(shí)間調(diào)控MMP-2濃度以降低軟骨基質(zhì)的降解，從而減緩炎癥的行程，盡管高烏甲素對(duì)IL-1β的調(diào)節(jié)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異沒有顯著性，但從結(jié)果可以看出，給藥4周后高烏甲素組的濃度是低于模型組的，而停止給藥后出現(xiàn)反彈，但與模型組比較差異不顯著，這也更進(jìn)一步說明高烏甲素對(duì)IL-1β的調(diào)控作用時(shí)間具有即時(shí)性。在給藥6周后，高烏甲素對(duì)關(guān)節(jié)液MMP-2的表達(dá)的顯著降低作用提示高烏甲素的局部治療作用。但在關(guān)節(jié)炎晚期，高烏甲素的治療作用不顯著，綜上所述，高烏甲素治療關(guān)節(jié)炎需在早期才能達(dá)到好的療效。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中高烏甲素雖然不能在關(guān)節(jié)炎發(fā)病的任何時(shí)期對(duì)IL-1β、MMP-2的表達(dá)有顯著作用，卻也證實(shí)了關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制與這二種因子的異常表達(dá)有關(guān)，這與前人研究結(jié)論相一致。結(jié)合病理切片和炎癥細(xì)胞因子濃度檢測(cè)結(jié)果推斷，關(guān)節(jié)軟骨的自我修復(fù)也起到重要作用，提示高烏甲素早期治療可能是通過調(diào)控炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨的自我修復(fù)能力而達(dá)到治療作用的。此外，由于Hulth造模法復(fù)制的模型易造成關(guān)節(jié)通路手術(shù)創(chuàng)傷及炎癥且病變限制于內(nèi)側(cè)室［13］，提示高烏甲素直接作用于病灶的治療方法的有效性。為高烏甲素臨床治療膝骨性關(guān)節(jié)炎提供了理論依據(jù)。

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