兩種木麻黃變異類型的抗鹽性比較

鄔 金，溫國勝，張汝明，陳嘉琦

（浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安 311300）

木麻黃（Casuarina equisetifolia）引種栽培于熱帶、亞熱帶地區(qū)的濱海疏松沙土中，為多用途速生樹種[1～2]。對于植物逆境的生理適應(yīng)性研究前人已經(jīng)進行了深入探討，但有關(guān)木麻黃在逆境適應(yīng)性方面的研究還需要更進一步的探索。鑒于當(dāng)前浙江沿海防護林建設(shè)中高大喬木樹種貧乏，沿海生態(tài)環(huán)境日益惡化的現(xiàn)狀，篩選抗逆性較強的木麻黃優(yōu)良無性系，對浙江沿海林業(yè)生態(tài)建設(shè)有重要的理論意義和實用價值。

海岸沙地土壤鹽分較高，含水量較低，且持水力較差，木麻黃能夠在這種惡劣的環(huán)境中作為先鋒樹種正常生長繁衍，這與它本身良好的抗逆適應(yīng)性是分不開的[3]。本實驗將結(jié)合丙二醛（MDA）含量和抗氧化酶活性的測定，研究NaCl脅迫下木麻黃的逆境生理響應(yīng)機制，旨在為浙江省木麻黃的北移馴化篩選優(yōu)良類型，提供切實的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗地設(shè)于浙江省臨安市浙江農(nóng)林大學(xué)東湖校區(qū)的平山苗圃，30° 14′ N，119° 42′ E，屬中緯度北亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，四季分明，氣候溫和，雨量充沛，但晝夜溫差大。多年平均氣溫為15.80℃，其中7月為最熱月，平均溫度為28.10℃，1月為最冷月，平均氣溫為3.40℃，極端高溫為41.90℃，極端低溫為－13.30℃。全年降水量1 628.6 mm，歷年平均日照明數(shù)為1 939 h，無霜期234 d。

供試材料為浙江省臺州市玉環(huán)縣大鹿島篩選出的兩種木麻黃變異類型。將各變異類型按照樹皮顏色分為黑皮和紅皮，編號分別為B1和R5。于2010年5月將各類型的種子播種在浙江省臨安市浙江農(nóng)林大學(xué)東湖校區(qū)的平山苗圃進行培育。選取苗齡1 a長勢優(yōu)良的木麻黃實生苗的新鮮葉片作為試驗材料。

于2011年9月22日剪取大棚內(nèi)長勢一致的木麻黃2種變異類型（B1和R5）試驗苗健壯枝條（長度為20 ～30 cm），培養(yǎng)于盛有NaCl溶液的150 mL錐形瓶中，對其進行鹽脅迫處理，NaCl溶液濃度分為6組，分別為0、50、100、150、200和 250 mmol/L（相應(yīng)的處理號為B11、B12、B13、B14、B15、B16和R51、R52、R53、R54、R55、R56），處理時間共5 d。為防止水分蒸發(fā)和植株蒸騰作用導(dǎo)致鹽溶液濃度改變，確保NaCl溶液液面不下降，每隔6 h補充些蒸餾水。分別于處理前1 d（記作0 d，作為對照）和處理后每隔24 h（分別記作1、2、3、4、5 d）取相同生長點部位的葉片進行抗氧化物酶（SOD、POD、CAT）活性和丙二醛（MDA）含量測定，每次測定均重復(fù)3次，取其平均值。

1.2 試驗方法

植物抗氧化酶包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase，POD）、過氧化氫酶（catalase，CAT），測定參照陳建勛等方法[4]。SOD活性以抑制氮藍四唑（NBT）光化還原 50%為一個酶活性單位（U）。POD活性以O(shè)D470每分鐘的增加1為一個酶活性單位（U）。CAT活性以使OD240每分鐘的減少0.01為一個活性單位（U）。酶活性單位為U/g Protein。

MDA含量：參照李合生[5]的方法（略有改動）進行測定，其含量用μmol/gFW表示。原始數(shù)據(jù)用Excel 2003和SPSS13.0進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl脅迫對兩種木麻黃變異類型SOD活性的影響

活性氧在植物體內(nèi)的清除是由保護酶和抗氧化物質(zhì)來完成的。SOD是一種具有特定生物催化功能的蛋白質(zhì)，廣泛存在于自然界中，包括動物體、植物體以及一些微生物體內(nèi)，它在保護植物抗氧化的作用上起著主要作用[6]。由圖1可以看出，在不同濃度的NaCl溶液處理下，兩種木麻黃變異類型的SOD活性均隨時間的推移呈現(xiàn)先上升后下降，總體趨勢基本一致。

B1的SOD活性在各處理期間均高于對照，從每個處理第1天到第2天迅速升高，并在第2天達到最大值，之后緩慢下降。這說明B1能夠通過增加體內(nèi)SOD活性來適應(yīng)NaCl脅迫，且各處理第5天的SOD值均高于對照，幫助消除了NaCl 脅迫帶來的O2－積累，不足以對B1機體產(chǎn)生很大傷害。

R5的SOD活性在各處理期間較對照不盡相同，除了在100 mmol/L的NaCl脅迫處理下，R5的SOD活性于處理第3天達到最大值，在其他處理下R5的SOD活性均于處理第2天達到最大值。在0 mmol/L的NaCl處理第5天R5的SOD活性仍高于對照，這說明R5在0 mmol/L的NaCl處理下可能受到自身營養(yǎng)脅迫，致使其需要通過調(diào)節(jié)SOD活性來消除營養(yǎng)脅迫產(chǎn)生的機體傷害，而其他濃度的NaCl處理第5天R5的SOD活性均小于對照，這表明R5體內(nèi)受到NaCl脅迫的傷害加劇，雖然前3天能夠通過增強SOD活性來抵御逆境威脅，但積累的O2－增多，R5體內(nèi)更容易發(fā)生過氧化作用。就SOD活性來說，B1更強，R5變化幅度不大相對穩(wěn)定。但如果憑靠SOD活性的強弱來判斷抗性強弱是不科學(xué)的，有科學(xué)試驗證明，單獨提高一種酶的活性，對于植物抗氧化能力的提高影響不太顯著[7]，因此還需要結(jié)合POD和CAT兩種抗氧化酶活性強弱來進一步分析。

圖1 NaCl脅迫下木麻黃葉片SOD活性的變化Figure1 Change of SOD activity in leaves of C.equisetifolia under NaCl stress

2.2 NaCl脅迫對兩種木麻黃變異類型POD活性的影響

POD位于非原生質(zhì)體中，它能減輕環(huán)境脅迫產(chǎn)生的過氧化物造成的膜脂過氧化傷害[8]。由圖2可以看出，兩種木麻黃變異類型在不同濃度NaCl溶液處理下的POD活性變化趨勢有明顯差異。B1的POD活性相較對照變化規(guī)律基本一致，呈現(xiàn)先降后升再降的趨勢，在0 ～ 150 mmol/L的NaCl溶液處理，于第4天達到最大值；而在200～ 250 mmol/L的NaCl溶液處理下，POD活性均小于對照，說明此濃度的NaCl溶液對B1的脅迫增強。R5的POD活性在0 ～ 200 mmol/L的NaCl溶液處理下均比對照高，變化規(guī)律比較一致，呈先降后升的趨勢，其中在0 ～ 150 mmol/L的NaCl溶液處理下于第5天達到最大值；在NaCl溶液處理濃度為200 ～ 250mmol/L的條件下，R5的POD活性呈先升后降的趨勢，并于處理第3天達到最大值，在250 mmol/L的NaCl脅迫下，R5的POD活性在處理第5天低于對照，這可能是由于NaCl脅迫濃度增強使得R5受到嚴重傷害，POD活性受到抑制或被氧化分解。相較于B1，R5的POD活性相對較高。由于超氧化物歧化酶和過氧化物酶都是植物細胞的保護酶，能夠清除H2O2和O2－自由基來保護細胞膜，兩種木麻黃變異類型在不同濃度NaCl溶液處理中SOD和POD活性各有高低，雖然不能立即判斷出哪種類型的抗鹽性更強，但能看到的是，兩種類型均能通過提高SOD和POD活性來抵抗NaCl脅迫對細胞膜的傷害，都具有一定的抗鹽性。

圖2 NaCl脅迫下木麻黃葉片POD活性的變化Figure2 The change of POD activity in leaves of C.equisetifolia under NaCl stress

2.3 NaCl脅迫對兩種木麻黃變異類型CAT活性的影響

CAT主要存在于線粒體和微體中，是清除過氧化氫的主要酶之一[8]。由圖3可以看到，隨著脅迫NaCl濃度的增加，兩種木麻黃變異類型葉片的CAT活性也相應(yīng)增加。有所不同的是，它們的變化趨勢有明顯差異。如圖3所示，在0 ～ 150 mmol/L的NaCl處理下，B1的CAT活性均一直趨于上升狀態(tài)；在200 ～ 250 mmol/L的NaCl處理下，B1的CAT活性均呈現(xiàn)先升后降趨勢，在250 mmol/L的NaCl溶液處理第5天低于對照。而R5的CAT活性在不同濃度NaCl處理下均隨時間的推移呈現(xiàn)正相關(guān)趨勢，且都比對照高。綜合來看，R5的CAT活性于處理后期明顯高于B1。這說明在同等脅迫處理條件下，R5比B1要更具抗鹽性，B1在200 mmol/L以上的NaCl溶液中的CAT活性較低，植物體內(nèi)細胞膜受到的傷害較大。

圖3 NaCl脅迫下木麻黃葉片CAT活性的變化Figure3 Change of CAT activity in leaves of C.equisetifolia under NaCl stress

2.4 NaCl脅迫對兩種木麻黃變異類型MDA含量的影響

由圖4可以看出，整個處理期間兩種木麻黃變異類型葉片中的MDA含量在NaCl脅迫下均呈現(xiàn)上升趨勢，且隨著處理時間的增加和處理NaCl濃度的增加，MDA含量也相應(yīng)增加。其中，兩種類型在不同濃度NaCl處理下的第1天較對照的MDA含量相差不大，處理第2天MDA含量開始增加，第3天到第5天急劇增加，并均于各處理第5天達到最大值。MDA含量的增加，表明細胞膜脂過氧化程度加強，質(zhì)膜結(jié)構(gòu)和功能都受到一定程度的損害。隨著NaCl處理濃度的增大，B1的MDA含量逐漸高于R5，表明NaCl脅迫下B1葉片膜脂過氧化較R5嚴重。

圖4 NaCl脅迫木麻黃葉片MDA含量的變化Figure4 Change of MDA content in leaves of C.equisetifolia under NaCl stress

3 結(jié)論與討論

植物的細胞質(zhì)被質(zhì)膜包裹，質(zhì)膜是一種由類脂和蛋白質(zhì)構(gòu)成的生物膜[9]。細胞質(zhì)膜具有維持細胞穩(wěn)定性和選擇透性的獨特功能，植物細胞需要通過質(zhì)膜才能與外界環(huán)境進行物質(zhì)交換。因此各種不良環(huán)境因素都能對細胞產(chǎn)生影響，首先作用的就是細胞質(zhì)膜[10]。若質(zhì)膜受到不同程度的傷害，就不能正常進行物質(zhì)能量代謝，這使得植物體自身構(gòu)建一定的細胞質(zhì)膜保護系統(tǒng)。根據(jù)質(zhì)膜保護系統(tǒng)相關(guān)的酶活性狀況可以判斷出質(zhì)膜系統(tǒng)是否受到傷害以及傷害程度。當(dāng)遭受鹽脅迫時，植物體內(nèi)的活性氧增加，膜脂過氧化加劇，抗鹽植物通過增強活性氧的清除能力來減輕對細胞質(zhì)膜的傷害[11]。作為質(zhì)膜保護系統(tǒng)的主要抗氧化酶，SOD是抵御活性氧傷害的第一道防線，它負責(zé)將O2－歧化成H2O2和O2，然后在通過POD和CAT將H2O2清除分解成H2O和O2，使活性氧對植物的傷害降低。張勇[12]等通過對木麻黃無性系水培苗抗鹽性研究得出，在鹽脅迫處理下，POD活性可作為評價木麻黃水培苗抗鹽的主要形狀指標。

本試驗結(jié)果表明，在不同濃度NaCl脅迫處理下，兩種木麻黃變異類型B1和R5葉片中的MDA含量明顯增加，表明質(zhì)膜系統(tǒng)受到了傷害，但抗氧化物酶活性也有相應(yīng)的增強，說明植物體通過增加酶活性來清除活性氧，為質(zhì)膜保護系統(tǒng)減免更多的損傷。B1的SOD活性較R5高，而R5的POD活性和CAT活性都比B1高，B1的MDA含量相較R5高，說明B1葉片細胞內(nèi)O2－更多，比R5受到傷害更大。綜合抗氧化物酶活性和MDA含量測定指標的分析得出，R5比B1更具抗鹽性，這和張勇等的分析結(jié)果相符。

木麻黃在鹽脅迫下生理指標表現(xiàn)出的特征，可能與高NaCl濃度產(chǎn)生水分脅迫造成木麻黃生理干旱而導(dǎo)致的傷害[13]。就目前的試驗結(jié)果來看，變異類型R5的抗鹽性更適宜進行優(yōu)良基因的篩選，然而筆者只是從植物生理上做一些初步的探索，為木麻黃的優(yōu)良變異類型篩選擴散提供一定的理論依據(jù)。對于更好的鑒定和篩選具有較強抗寒能力的變異類型或品種，還需要在細胞分子和基因水平上作進一步的研究和分析。

[1]葉功富，羅美娟，林金木.短枝木麻黃在福建東山試點的種源試驗結(jié)果分析與選擇[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2004，26（6）：6－11.

[2]葉功富，王小云，盧昌義，等.閩南沿海木麻黃基干林帶的防風(fēng)效應(yīng)[J].海峽科學(xué)，2008（10）：77－79.

[3]鄭金雙.木麻黃逆境生理研究進展[J].亞熱帶植物科學(xué)，2006，35（2）：70－73.

[4]陳建勛，王曉峰.植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)[M].華南理工大學(xué)出版社，2002.

[5]李合生.植物生理生化實驗原理和技術(shù)[M].高等教育出版社，2000.

[6]曹淑華，查向東.超氧化物歧化酶研究綜述[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003，31（4）：599－601.

[7]馬旭俊，朱大海.植物超氧化物歧化酶（SOD）的研究進展[J].遺傳，2003，25（2）：225－231.

[8]Shigeoka S, Ishikawa T, Tamoi M,et al.Regulation and function of ascorbate peroxidase isoenzymes[J].J Exper Bot, 2002, 53（372）：1 305－1 319.

[9]余叔文，植物學(xué)，湯章城，等.植物生理與分子生物學(xué)[M].科學(xué)出版社，1998.

[10]林棲鳳.耐鹽植物研究[M].科學(xué)出版社，2004.

[11]楊淑慎，高俊鳳.活性氧、自由基與植物的衰老[J].西北植物學(xué)報，2001，21（2）：215－220.

[12]張勇，仲崇祿，姜清彬，等.木麻黃無性系水培苗抗鹽性研究[J].林業(yè)科學(xué)研究，2008（1）：91－95.

[13]葉功富，吳平陽，王玨新，等.木麻黃抗旱耐鹽機理及其在防護林更新改造中的應(yīng)用[J].防護林科技，2000（S1）：142－147.