針刺對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠外周血清IL－1β、IL－6表達(dá)的影響*

張亞敏，陳素輝，孫 華△，徐 虹，包 飛，王道海，高 揚(yáng)

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院，北京100730;2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京100005)

缺血性腦血管病屬中醫(yī)“中風(fēng)”范疇。多年來(lái)，針刺治療腦血管病取得了良好療效。研究顯示電針能促進(jìn)腦缺血大鼠缺血區(qū)血管再生，增加腦血流量，減輕缺血區(qū)細(xì)胞凋亡[1－2];且能調(diào)節(jié)腦缺血再灌注區(qū)基質(zhì)金屬蛋白酶－9(MMP－9)及細(xì)胞間黏分子－1(ICAM－1)等炎癥損傷相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，減輕缺血再灌注后的腦水腫和腦組織損傷[]。外周血是機(jī)體宏觀調(diào)節(jié)信號(hào)的有效載體，通過(guò)檢測(cè)外周血中相關(guān)信號(hào)的變化可以反映腦組織局部的炎癥損傷程度及機(jī)體對(duì)局部損傷和損傷修復(fù)相關(guān)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的變化。研究表明針刺百會(huì)和足三里穴能夠影響腦缺血再灌注損傷大鼠外周血清蛋白的表達(dá)，干預(yù)其生理病理過(guò)程[4]。本研究通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)大鼠外周血清中白細(xì)胞介素1β(IL－1β)、白細(xì)胞介素6(IL－6)的表達(dá)，探討針刺百會(huì)和足三里穴在腦缺血再灌注損傷炎癥調(diào)節(jié)機(jī)制中的可能作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性SD大鼠，清潔級(jí)，體重260～310 g，10～12周齡，中國(guó)藥品生物制品檢定所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物證書(shū):SCXK(京)2009－0017]。飼養(yǎng)條件:每籠5 只，光照:黑暗 =12 h∶12 h，室溫(25 ±3)℃，濕度75%，自由進(jìn)食和飲水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作參照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究指南。

1.2 主要試劑和器材設(shè)備

2636－4A、2634－4A線栓(北京沙東生物技術(shù)公司);長(zhǎng)城牌KWD－808Ⅱ全能脈沖電療儀(常州市武進(jìn)長(zhǎng)城醫(yī)療器械有限公司);漢醫(yī)牌一次性無(wú)菌針灸針(天津華鴻醫(yī)材有限公司);全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司);雙抗體夾心IL－1β ELISA試劑盒，雙抗體夾心IL－6 ELISA試劑盒(美國(guó)eBioscience公司);漩渦混合器(北京北德科學(xué)器材有限公司)。

1.3 模型制備和神經(jīng)功能評(píng)分

模型制備參考Longa等[5]的線栓法。線栓插入2 h后拔出以實(shí)現(xiàn)再灌注，待大鼠蘇醒對(duì)其行神經(jīng)功能評(píng)分，判斷造模是否成功。神經(jīng)功能評(píng)分依據(jù)Bederson等[6]的5級(jí)分類法:0級(jí):神經(jīng)功能無(wú)缺損;1級(jí):左前肢不能完全伸展;2級(jí):左前肢屈曲，向左側(cè)推動(dòng)時(shí)阻力下降;3級(jí):爬行時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈;4級(jí):意識(shí)不清，包括24 h內(nèi)死亡。將0級(jí)和4級(jí)剔除實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組與處理

將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和針刺組3個(gè)大組，每大組按照缺血再灌注后時(shí)間分成12 h、24 h、48 h、72 h、96 h 和144 h共6 個(gè)亞組，每亞組8 只大鼠;另外設(shè)正常對(duì)照組8只。假手術(shù)組模擬手術(shù)損傷，分離至頸內(nèi)、外動(dòng)脈，不插入線栓，縫合，不治療;模型組造模成功后不治療;針刺組造模成功后，定位百會(huì)和足三里穴[7]，消毒后進(jìn)針，針柄連接脈沖電療儀，疏密波，強(qiáng)度 2 mA，頻率 2～100 Hz，日 1次，每次20 min;正常對(duì)照組作為空白對(duì)照，不施手術(shù)，不治療。

1.5 IL －1β、IL －6 測(cè)定

各組大鼠按規(guī)定時(shí)間點(diǎn)用4%水合氯醛腹腔注射麻醉，心臟取血，室溫靜置 2 h，離心(3 500 rpm，20 min)，分離血清，分裝血清，存放于－80℃冰箱中備用。取備用血清用ELISA法測(cè)IL－1β、IL－6值，具體操作嚴(yán)格遵循試劑盒說(shuō)明。

1.6 ELISA數(shù)據(jù)讀取與分析

在酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)OD 值，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值及其相應(yīng)的已知濃度，做相關(guān)分析。然后以O(shè)D值為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)，做一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得出R2(相關(guān)系數(shù))值和求解樣品濃度的公式，計(jì)算樣品濃度。本數(shù)據(jù)為計(jì)量資料，滿足正態(tài)性和方差齊性，采用單因素方差分析(one－way ANOVA)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較應(yīng)用LSD－t檢驗(yàn)，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)表示，P＜0.05為差異具有顯著性。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 各組大鼠外周血清IL－1β表達(dá)的變化

IL－1β在模型組呈雙峰形表達(dá)，峰值時(shí)間分別為24 h和96 h。IL－1β在針刺組表達(dá)強(qiáng)度低于模型組，以24 h組和96 h組最顯著(P＜0.05);IL－1β在假手術(shù)組表達(dá)低于模型組，其中96 h組差異具有顯著性(P＜0.05)。見(jiàn)表1及圖1。

表1 實(shí)驗(yàn)各組大鼠外周血清不同時(shí)間點(diǎn)IL－1β濃度值(±s)

表1 實(shí)驗(yàn)各組大鼠外周血清不同時(shí)間點(diǎn)IL－1β濃度值(±s)

注:與模型組比較，☆P ＜0.05;與假手術(shù)組比較，△P ＜0.05;與正常組比較，*P ＜0.05。

12 h 24 h 48 h 72 h 96 h 144 h針刺組 8 81.88 ±16.9* 60.50 ±18.01☆△＊ 95.78 ±30.21 72.01 ±24.40* 96.21 ±37.29☆ 90.05 ±36.87組別 n*模型組 8 75.76 ±13.6* 118.02 ±45.24 88.98 ±54.23* 84.85 ±49.61* 157.23 ±19.36△ 67.51 ±4.32*假手術(shù)組 8 83.56 ±20.00*105.45 ±43.83 95.83 ±31.15 94.16 ±11.85 63.81 ±22.00* 86.47 ±22.69*正常組 8 123.05 ±58.64 123.05 ±38.64 123.05 ±38.64 123.05 ±38.64 123.05 ±38.64 123.05 ±38.64

表2 實(shí)驗(yàn)各組大鼠外周血清不同時(shí)間點(diǎn)IL－6濃度值(±s)

表2 實(shí)驗(yàn)各組大鼠外周血清不同時(shí)間點(diǎn)IL－6濃度值(±s)

注:與模型組比較，☆P ＜0.05;與假手術(shù)組比較，△P ＜0.05;與正常組比較，*P ＜0.05。

12 h 24 h 48 h 72 h 96 h 144 h針刺組 8 39.02 ±4.54* 37.32 ±7.52△ 34.86 ±4.69☆△ 53.48 ±33.06* 41.23 ±6.83* 42.96 ±3.72組別 n*模型組 8 38.38 ±3.63* 40.87 ±5.55＊△ 39.77 ±3.55* 42.90 ±8.65 40.91 ±6.87* 43.29 ±11.46*假手術(shù)組 8 39.07 ±5.33* 49.83 ±3.40* 42.86 ±9.44* 52.66 ±14.39* 42.32 ±6.23* 43.92 ±5.04*正常組 8 35.12 ±3.81 35.12 ±3.81 35.12 ±3.81 35.12 ±3.81 35.12 ±3.81 35.12 ±3.81

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠外周血清IL－1β表達(dá)的變化

圖2 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠外周血清IL－6表達(dá)的變化

2.2 各組大鼠外周血清IL－6表達(dá)的變化

IL－6在模型組的表達(dá)高于正常組(P＜0.05);IL－6在針刺組各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)低于模型組和假手術(shù)組，其中24 h和48 h組具有顯著性差異(P＜0.05)。IL－6在假手術(shù)組中呈雙峰形表達(dá)，峰值時(shí)間在24 h和72 h，假手術(shù)組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)IL－6的表達(dá)高于模型組，但除24 h組外，其余時(shí)間點(diǎn)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表2及圖2。

3 討論

缺血性腦卒中主要病機(jī)為臟腑陰陽(yáng)失調(diào)，導(dǎo)致機(jī)體氣血逆亂，上犯腦竅，腦絡(luò)瘀阻而發(fā)病。根據(jù)中醫(yī)經(jīng)絡(luò)理論，腦缺血后機(jī)體正氣不足，屬于積損正衰。百會(huì)穴屬督脈，位于巔頂，“頭者神之居”為“精明之府”，且督脈總督一身之陽(yáng)，具有開(kāi)竅醒神之功。足三里穴為足陽(yáng)明胃經(jīng)的合穴，陽(yáng)明經(jīng)多氣多血，臨床選穴有“治痿獨(dú)取陽(yáng)明”原則。兩穴合用可疏經(jīng)活絡(luò)、扶正祛邪以調(diào)節(jié)機(jī)體陰陽(yáng)平衡。根據(jù)導(dǎo)師多年的臨床經(jīng)驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)總結(jié)，發(fā)現(xiàn)針刺百會(huì)和足三里穴在治療神經(jīng)系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)疾病等方面優(yōu)勢(shì)顯著。

IL－1β在正常腦組織中低表達(dá)，腦缺血再灌注損傷后，由局部浸潤(rùn)的單核－巨噬細(xì)胞、活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞等分泌，可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖并表達(dá)粘附分子，募集白細(xì)胞，刺激單核－巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF －a、IL－6等細(xì)胞因子，加重局部炎癥反應(yīng)[8]。還可通過(guò)上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)水平破壞血腦屏障[9]，進(jìn)而使中樞腦組織的炎癥反應(yīng)信號(hào)通過(guò)血液傳遞至外周，活化外周免疫系統(tǒng)中的炎性細(xì)胞;同時(shí)可募集外周炎性細(xì)胞至中樞損傷腦區(qū)，參與中樞損傷及損傷修復(fù)過(guò)程。腦缺血再灌注后24 h，外周血炎性細(xì)胞因子(如IL－1β、IL－6)大量表達(dá)于粘附分子和趨化因子等可募集炎癥細(xì)胞，移行至缺血損傷區(qū)，進(jìn)一步破壞血腦屏障，加重局部神經(jīng)元壞死，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)[10]。

IL－6在腦缺血急性期是重要的炎癥介質(zhì)，可導(dǎo)致腦炎性損傷，但在腦缺血亞急性期IL－6通過(guò)連同白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)及睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)等發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[11]。且外周血中的IL－6水平是反應(yīng)腦缺血損傷早期的靈敏性指標(biāo)，研究[12]顯示，MCAO模型中IL－6在外周血2 h即開(kāi)始上升，早于腦組織開(kāi)始上升時(shí)間(24 h)。

本研究顯示，腦缺血再灌注損傷后，模型組大鼠外周血清中的IL－1β在缺血再灌注24 h后出現(xiàn)第1個(gè)峰值，該峰值信號(hào)一般反映炎癥的損傷程度，96 h達(dá)到第2個(gè)峰值，由于中后期峰值的表達(dá)通常由早期的損傷信號(hào)和中后期的損傷修復(fù)信號(hào)疊加形成，故后者強(qiáng)度高于前者。本實(shí)驗(yàn)中，假手術(shù)組大鼠外周血清的IL－6表達(dá)高于模型組，國(guó)外研究[]中亦發(fā)現(xiàn)有相似結(jié)果。腦缺血再灌注模型是一種高強(qiáng)度的病理性應(yīng)激反應(yīng)，損傷應(yīng)激程度高于假手術(shù)組，考慮是模型組釋放的兒茶酚胺類和糖皮質(zhì)激素等應(yīng)激激素較假手術(shù)組多，而這些激素可抑制免疫系統(tǒng)的應(yīng)答活化，減少免疫細(xì)胞因子的表達(dá)，故模型組的IL－6表達(dá)水平低于假手術(shù)組。實(shí)驗(yàn)中正常組大鼠外周血清IL－1β表達(dá)較模型組高，尚未找到有關(guān)證據(jù)支持，考慮外周血影響因素較多，這種情況可能由于實(shí)驗(yàn)誤差導(dǎo)致，有待進(jìn)一步探討。

本研究觀察到，腦缺血再灌注早期，針刺組大鼠外周血清炎性細(xì)胞因子IL－1β、IL－6的表達(dá)低于未經(jīng)干預(yù)的腦缺血模型組;腦缺血中后期，隨著炎癥損傷反應(yīng)的抑制，針刺組大鼠外周血清中的IL－1β表達(dá)強(qiáng)度低于模型組，而IL－6表達(dá)上升，提示針刺百會(huì)、足三里穴在腦缺血損傷早期可能通過(guò)下調(diào)外周血清IL－1β、IL－6的表達(dá)抑制炎癥反應(yīng)，腦缺血損傷中后期可能通過(guò)上調(diào)IL－6的表達(dá)促進(jìn)腦組織的損傷修復(fù)，發(fā)揮腦保護(hù)作用。

[1]Wang Q，Li X，Chen Y，et al.Activation of epsilon protein kinase C －mediated anti－apoptosis is involved in rapid tolerance induced by electroacupuncture pretreatment through cannabinoid receptor type 1[J].Stroke，2011，42(2):389 －396

[2]Du Y，Shi L，Li J，et al.Angiogenesis and improved cerebral blood flow in the ischemic boundary area were detected after electroacupuncture treatment to rats with ischemic stroke[J].Neurol Res，2011，33(1):101－107

[3]徐虹，洪禮傳，黃艷秋，等.針刺對(duì)腦缺血再灌注模型大鼠腦組織基質(zhì)金屬蛋白酶、細(xì)胞間黏附分子表達(dá)的影響[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2010，30(7):731 －736

[4]陳素輝，孫華，徐虹，等.針刺干預(yù)對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠外周血清蛋白表達(dá)的影響[J].針灸臨床雜志，2011，27(9):50－53

[5]Longa E Z，Weinstein P R，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke，1989，20(1):84－91

[6]Bederson J B，Pitts L H，Tsuji M，et al.Rat middle cerebral artery occlusion:evaluation of the model and development of a neurologic examination[J].Stroke，1986，17(3):472 － 476

[7]李忠仁.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)[M]北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2007:255

[8]Allan S M，Tyrrell P J，Rothwell N J.Interleukin －1 and neuronal injury[J].Nat Rev Immunol，2005，5(8):629 －640

[9]Pera J，Zawadzka M，Kaminska B，et al.Influence of chemical and ischemic preconditioning on cytokine expression after focal brain ischemia[J].J Neurosci Res，2004，78(1):132 －140

[10]Denes A，Thornton P，Rothwell N J，et al.Inflammation and brain injury:acute cerebral ischaemia，peripheral and central inflammation[J].Brain Behav Immun，2010，24(5):708 － 723

[11]Suzuki S，Tanaka K，Suzuki N.Ambivalent aspects of interleukin －6 in cerebral ischemia:inflammatory versus neurotrophic aspects[J].J Cereb Blood Flow Metab，2009，29(3):464 －479

[12]Chapman K Z，Dale V Q，Denes A，et al.A rapid and transient peripheral inflammatory response precedes brain inflammation after experimental stroke[J].J Cereb Blood Flow Metab，2009，29(11):1764－1768

[13]Jeong S，Kim S J，Jeong C，et al.Neuroprotective effects of remifentanil against transient focal cerebral ischemia in rats[J].J Neurosurg Anesthesiol，2012，24(1):51 －57