伊曲康唑注射液對小鼠的亞慢性毒性研究

劉 云，李德軍，姜 巖，王海彬，祝玉卿，陳 曦，陳 亮

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150030）

伊曲康唑（itraconazole，ITZ）是第二代三唑類合成抗真菌藥，對念珠菌及酵母、真菌、皮膚癬菌和其他致病真菌具有廣譜抗真菌活性。該藥可破壞真菌細(xì)胞膜中麥角甾醇的合成，在正常狀況下，麥角甾醇的前體羊毛甾醇在細(xì)胞色素P450酶的催化下，完成14α－去甲基作用。應(yīng)用該藥后，ITZ阻斷14α－去甲基作用，干擾麥角甾醇合成，使得真菌細(xì)胞膜的通透性改變，最終發(fā)揮抗真菌活性［1］。

筆者利用環(huán)糊精包合技術(shù)，制備出伊曲康唑注射液［2］。本試驗(yàn)通過伊曲康唑?qū)π∈筮B續(xù)背部皮下注射固定體積不同濃度的伊曲康唑，通過對小鼠體重、肝臟和腎臟主要酶的變化及肝腎組織學(xué)的觀測，旨在研究該注射液在小鼠體內(nèi)的亞慢性毒性作用，從而為臨床合理用藥提供重要的理論依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物 伊曲康唑注射液（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院外科教研室自制，批號：20091004）；伊曲康唑原粉（購自湖北健源化工有限公司，批號：090223）；羥丙基－β－環(huán)糊精（購自湖北健源化工有限公司，批號：090311）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 昆明系小鼠80只，體重為（16±0.5）g，購自黑龍江省中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.3 試劑盒 GPT、GOT、ALP、CRE、BUN 測定試劑盒，購自長春匯力生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 給藥方案 80只小鼠隨機(jī)分為4組，每組20只，雌雄各半。其中，1～3組為試驗(yàn)組，即低劑量組、中劑量組、高劑量組。給藥劑量分別為30mg／kg·d，60mg／kg·d和90mg／kg·d。第4組為空白對照組。采用背部皮下給藥法，藥液用生理鹽水稀釋，按0.01mL／g體重連續(xù)給藥1個(gè)月［3］，空白對照組注射同樣體積的生理鹽水。試驗(yàn)過程中，小鼠自由進(jìn)食及自由飲水。每天稱重，調(diào)整給藥劑量。用藥后的第29天進(jìn)行血液生化指標(biāo)測定和肝腎組織的切片處理。

2.2 觀察記錄和體重變化 每天稱量各組小鼠體重，并觀察小鼠的飲食、行為活動及臨床癥狀等變化。用SPSS軟件處理數(shù)據(jù)。結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠體重的變化

2.3 血液生化指標(biāo)測定 檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）、堿性磷酸酶（ALP）、肌酐（CRE）和尿素氮（BUN）。用SPSS軟件處理數(shù)據(jù)。結(jié)果見表2。

表2 小鼠肝腎指標(biāo)的變化

2.4 肝腎組織的切片處理 對各組小鼠眼球采血后，進(jìn)行剖檢，對外觀有疑似病變的肝臟、腎臟和部分外觀正常的肝臟、腎臟，用4%甲醛溶液固定，制作切片，H.E.染色。

3 結(jié)果

3.1 試驗(yàn)觀察和數(shù)據(jù)記錄 在用藥后的前2天內(nèi)，高劑量組部分小鼠的精神狀態(tài)明顯不如其他組鼠，采食量下降、不愿活動。2d后，采食量逐漸恢復(fù)正常。其余時(shí)間內(nèi)各組小鼠的采食和飲水無明顯差異。整個(gè)試驗(yàn)過程中，低劑量組小鼠死亡1只，中劑量組小鼠死亡1只，高劑量組小鼠死亡2只。對死亡小鼠剖檢，無明顯病理變化。在體重變化方面見表1。

結(jié)果顯示，在第7天稱重時(shí)，中劑量組的平均體重與高劑量組和對照組比較，差異顯著（P＜0.05）。至28d時(shí)，高劑量組的平均體重與其他3組比較，差異顯著（P＜0.05）。

3.2 小鼠肝腎指標(biāo)的變化 結(jié)果顯示，高劑量組的GPT與其他3組相比，差異顯著（P＜0.05）。中劑量組的GOT與高劑量組和對照組比較，差異顯著（P＜0.05）。其他各酶值在各組間無差異性。

圖1 肝的組織切片 （H.E.×100）

3.3 肝腎組織切片 高劑量組部分小鼠的肝出現(xiàn)變性，細(xì)胞間隙變大等現(xiàn)象（圖1d），但在高倍鏡下，可看到壞死的肝細(xì)胞，肝細(xì)胞漿凝固，紅染，細(xì)胞界限不清，核濃縮（圖2d），說明長期的大劑量給藥對一部分小鼠的肝臟產(chǎn)生影響，甚至引起肝細(xì)胞局部變性、壞死。而腎臟的變化不明顯，從片中沒有發(fā)現(xiàn)病變部位（圖3和圖4）。

圖2 肝的組織切片 （H.E.×400）

圖3 腎的組織切片 （H.E.×100）

4 討論

在試驗(yàn)中，各組小鼠的體重在給藥后的第7天出現(xiàn)了差異性，這可能是幼年小鼠在此階段生長迅速，個(gè)體間差異導(dǎo)致而成，而在14d和21d稱重時(shí)，各組間差異不顯著，這也間接證明了前面的推論。在28d稱重時(shí)，高劑量組的體重與其他3組比較，差異顯著，這很可能是長期連續(xù)大量的用藥對小鼠的機(jī)體產(chǎn)生了影響，這也說明了藥物在體內(nèi)有一定程度的蓄積性。

圖4 腎的組織切片 （H.E.×400）

GPT是由肝臟合成并能直接反映肝功能變化重要酶之一，通常，GPT主要存在于肝細(xì)胞的胞漿中。正常情況下，肝細(xì)胞內(nèi)的GPT無法透過細(xì)胞膜，所以外周血中的GPT含量較低且恒定，但當(dāng)細(xì)胞膜受到損害時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的GPT向肝血竇溢出，進(jìn)入外周血中，致使血清中GPT含量升高。因此，GPT能敏感地反映肝細(xì)胞的損傷，主要是肝細(xì)胞膜的損傷程度［4］。試驗(yàn)結(jié)果顯示，高劑量組的GPT與其他3組相比，差異顯著（P＜0.05）。數(shù)值明顯高于其他3組，表明大劑量藥物影響肝臟功能，中劑量組的GOT與高劑量組和對照組比較，差異顯著（P＜0.05）。其他各酶值在各組間無差異性。對肝腎做石蠟切片，只發(fā)現(xiàn)高劑量組部分小鼠的肝臟出現(xiàn)了壞死，而其他各組肝腎結(jié)構(gòu)正常，這一方面解釋了伊曲康唑主要是通過肝臟代謝［5］，另一方面也間接說明了中劑量組的GOT升高可能是由于測量誤差造成，非肝臟出現(xiàn)器質(zhì)性變化。

曲生明等［6］通過給小鼠灌服伊曲康唑膠囊，分別測定治療劑量、中毒劑量、致死劑量組小鼠在用藥一段時(shí)間后的肝腎功能，并進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，結(jié)果顯示，2.5%的小鼠出現(xiàn)了輕度的肝酶升高，6.25%的小鼠病理檢查肝組織出現(xiàn)了輕度的脂肪變性，且結(jié)果異常的小鼠絕大多數(shù)發(fā)生于中毒劑量及致死劑量組，腎臟無明顯改變。這與試驗(yàn)所得結(jié)果基本一致。

［1］Leyden J.Pharmacokinetics and pharmacology of terbinafine and itraconazole［J］.J Am Acad Dermatol，1998，38（5）：42－47.

［2］劉恒平.伊曲康唑包合物的制備與研究［J］.中國生化藥物雜志，2008，29（3）：281－284.

［3］徐叔云.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，1991：205－213.

［4］王寶恩.肝臟病學(xué)新進(jìn)展－基礎(chǔ)與臨床［M］.北京：北京出版社，1996：59－61.

［5］陳子安，雷招寶.伊曲康唑的肝毒性反應(yīng)［J］.中國藥師，2004（3）：22－25.

［6］曲生明，李福秋，楊鑫，等.伊曲康唑安全性實(shí)驗(yàn)研究［J］.吉林醫(yī)學(xué)，2007，28（5）：584－586.