青藏高原牦牛多殺性巴氏桿菌熒光定量RQ－PCR檢測方法的建立

趙 靜，張紅見，馬梅琴，廖 明，陳 剛

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 人獸共患病防控制劑國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510642；2.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧810016；3.青海大學(xué)昆侖學(xué)院，青海 西寧810600）

牛出血性敗血癥（HSC）是由多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，P.multocida）引起的，以高熱、肺炎、間或呈現(xiàn)急性胃腸炎及內(nèi)臟器官出血為特征的牛傳染病，在青海省每年都季節(jié)性地散發(fā)和個(gè)別的群發(fā)，牦牛感染該菌后一般發(fā)病都比較急，病程較短，常常還未做出診斷便發(fā)生死亡，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，是青海省重點(diǎn)防控的一類動(dòng)物傳染病，目前獸醫(yī)臨床對該病的診斷仍普遍采用傳統(tǒng)的病原分離方法，不但復(fù)雜、費(fèi)時(shí)，而且敏感性低；普通PCR技術(shù)雖然具有簡便、快速、敏感和特異的優(yōu)點(diǎn)［1－2］，但它易出現(xiàn)假陽性以及引起的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境污染和染色劑具有致癌性等不足已引起學(xué)者們的注意。因此，建立簡單、快速、特異和敏感的牦牛出血性敗血癥檢測技術(shù)已迫在眉睫。

近年發(fā)展起來的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)將常規(guī)PCR技術(shù)與熒光檢測相結(jié)合，其核酸擴(kuò)增和檢測都在同一反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行，可以通過分析熒光信號判斷反應(yīng)結(jié)果，無需電泳檢測，解決了PCR假陽性和核酸染料溴化乙錠對環(huán)境的污染問題［3］。由于熒光信號強(qiáng)度與擴(kuò)增片段的數(shù)量成正比，還可以通過建立已知標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線對初始模板DNA進(jìn)行準(zhǔn)確定量，因此已成為檢測病原體的重要方法［4－5］。但在所查文獻(xiàn)中尚未見到以SYBR Green I染料為熒光指示劑的實(shí)時(shí)熒光定量RQ－PCR方法來檢測牦牛多殺性巴氏桿菌的報(bào)道。已經(jīng)證明［3］，KMT1基因是多殺性巴氏桿菌的種特異性基因，本研究參照GenBank中公布的KMT1基因的保守序列設(shè)計(jì)了一對引物，建立了以SYBR GreenⅠ染料為熒光指示劑的實(shí)時(shí)熒光定量RQ－PCR檢測方法，以期為青藏高原牦牛出血性敗血癥的早期診斷及感染程度的定量分析提供技術(shù)支持。報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株 牦牛源、藏羊源、豬源和禽源多殺性巴氏桿菌分離株于2008年～2011年分離自青海省不同地區(qū)，具體信息見表1。肺炎克雷伯氏菌ATCC700603、大腸埃希氏菌ATCC25922、傷寒沙門菌ATCC 14028均由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)教研室饋贈(zèng)。

表1 青藏高原動(dòng)物多殺性巴氏桿菌分離株

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank上公布的多殺性巴氏桿菌KMT1基因保守序列，采用Primer 5.0軟件，設(shè)計(jì)合成了1對引物，引物序列為：上游引物5′－TGCTCGTTGTGAGTGGGCT－3′，下游引物5′－CGCTCTGTCGTTAATGGCTTC－3′，擴(kuò)增長度為253 bp，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 模板DNA的制備 挑取經(jīng)分離培養(yǎng)、生化以及致病性試驗(yàn)鑒定為多殺性巴氏桿菌的分離株P(guān)0909單菌落于LB液體培養(yǎng)基（北京陸橋生物技術(shù)責(zé)任有限公司）中37℃振蕩培養(yǎng)18～24h。用TaKaRa公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒抽提模板DNA，提取方法按說明書進(jìn)行。

1.4 KMT1基因的PCR擴(kuò)增 采用自行設(shè)計(jì)的KMT1引物，以抽提的DNA模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：2×EasyTaq PCR Supermix 25 μL，上、下游引物1μL，模板DNA 1μL，ddH2O 22 μL，總體積50μL；反應(yīng)條件：94℃ 5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。

1.5 陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的Easypure Quick Gel Extraction Kit回收1.4中的PCR產(chǎn)物，獲得的253bp的目的基因片段與pEasyT1載體連接構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定的陽性克隆菌液送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序；取少量質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，用260nm紫外光測OD值，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)為8.31×1010個(gè)拷貝／μL，然后將其稀釋成1.0×1010個(gè)拷貝／μL質(zhì)粒液，再依次作10倍稀釋。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量RQ－PCR方法的建立

1.6.1 實(shí)時(shí)熒光定量RQ－PCR反應(yīng)條件 PCR Master Mix 10μL，上、下游引物（25pmon／L）0.5 μL，10倍系列稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品1μL，三蒸水20 μL，每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)，并做3個(gè)陰性水對照；反應(yīng)條件：94℃5min；94℃30s，55℃20s，72℃32 s，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線：95℃15s，60℃1min，95℃15s，1個(gè)循環(huán)。

1.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 曲線以反應(yīng)的Ct值為橫坐標(biāo)，以濃度（或拷貝數(shù)）為縱坐標(biāo)，兩者呈線性反比關(guān)系，繪制出一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6.3 特異性和敏感性試驗(yàn) 用建立的SYBR GreenⅠ熒光定量RQ－PCR方法檢測肺炎克雷伯氏菌、大腸埃希氏菌、傷寒沙門菌以及經(jīng)PCR鑒定的3株牦牛源、1株藏羊源、1株豬源、1株禽源多殺性巴氏桿菌，檢驗(yàn)該方法的特異性；將1.0×1010個(gè)拷貝／μL P0909標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒做10倍系列稀釋，在熒光定量PCR儀上檢測，計(jì)算該方法所能檢測到的最低拷貝數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 KMT1基因的PCR擴(kuò)增 應(yīng)用設(shè)計(jì)的引物對3株牦牛多殺性巴氏桿菌臨床分離株P(guān)m P0909、P0910、P1001進(jìn)行PCR擴(kuò)增試驗(yàn)（圖1）。

圖1 KMT1－1Forward／Reverse Primer對擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

對來自青海省祁連縣的3株牦牛多殺性巴氏桿菌分離株應(yīng)用KMT1－1上、下游引物進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，結(jié)果獲得的目的片段大小為253bp，符合設(shè)計(jì)引物的擴(kuò)增大小?；厥漳康钠?，并與pEasy T1載體連接構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒，將雙酶切鑒定陽性的質(zhì)粒測序，測序結(jié)果與參考序列完全一致。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以10倍系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒（1.0×100～1.0×1010拷貝／μL）做為模板，在熒光定量PCR儀上檢測，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖2）。

圖2 多殺性巴氏桿菌KMT－1基因SYBR GreenⅠ熒光定量RQ－PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

從構(gòu)建的SYBR GreenⅠ熒光定量RQ－PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線圖可知獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R值為0.9998。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量RQ－PCR的特異性和敏感性試驗(yàn) 用建立的多殺性巴氏桿菌SYBR GreenⅠ熒光定量RQ－PCR方法檢測肺炎克雷伯氏菌、大腸埃希氏菌、傷寒沙門菌等3株非巴氏桿菌菌株，結(jié)果肺炎克雷伯氏菌和傷寒沙門菌的波峰后移，形成的波峰與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的波峰有很大的差異，不能重合；而大腸埃希氏菌雖能形成于標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒相似的波峰，但是不能與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的波峰重合，而是波峰遷移，因此均為陰性（圖3）。同時(shí)對經(jīng)PCR鑒定的3株牦牛源、1株藏羊源、1株豬源、1株禽源多殺性巴氏桿菌進(jìn)行檢測，結(jié)果這6株多殺性巴氏桿菌的波峰與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的峰幾乎完全重合（圖4）。

將已經(jīng)計(jì)算出拷貝數(shù)的陽性標(biāo)準(zhǔn)品按10倍稀釋后，在熒光定量PCR儀上所能檢測到的最低拷貝數(shù)為1.0×100，見圖5。

圖3 SYBR GreenⅠ熒光定量RQ－PCR的特異性試驗(yàn)

圖4 SYBR GreenⅠ熒光定量RQ－PCR的特異性試驗(yàn)

3 討論

3.1 牦牛出血性敗血癥每年給青海省所造成的經(jīng)濟(jì)損失十分巨大，有些地區(qū)已成為該病暴發(fā)的疫源地，已引起當(dāng)?shù)赜嘘P(guān)部門的高度重視。因此，改進(jìn)檢測技術(shù)對于預(yù)防和控制該病具有重要的意義。

3.2 根據(jù)所查文獻(xiàn)，多以TaqMan探針熒光定量PCR方法檢測沙門菌病、病毒病等［6－7］，還未見到以SYBR Green I染料為熒光指示劑的實(shí)時(shí)熒光定量RQ－PCR方法檢測牦牛多殺性巴氏桿菌病的報(bào)道。通過本研究建立的熒光定量PCR檢測方法對牦牛源、豬源、藏羊源和禽源等6株經(jīng)PCR鑒定的菌株進(jìn)行了檢測，符合率為100%，同時(shí)用該方法檢測肺炎克雷伯氏菌、大腸埃希氏菌、傷寒沙門菌等3株非巴氏桿菌菌株，結(jié)果均不能與P0909標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的波峰重合，而是發(fā)生了波峰遷移；此外，通過對經(jīng)PCR鑒定的3株牦牛源、1株藏羊源、1株豬源、1株禽源多殺性巴氏桿菌進(jìn)行檢測，結(jié)果這6株多殺性巴氏桿菌的波峰與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的峰幾乎完全重合；特別是與文獻(xiàn)報(bào)道［8］的1對KMT－1引物相比，應(yīng)用本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)值（0.999 8）優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào)道的引物的相關(guān)系數(shù)值（0.993 7），在熒光定量PCR儀上所能檢測到的最低拷貝數(shù)為1.0×100。表明本研究建立的檢測方法特異性好，敏感性強(qiáng)。此外SYBR GreenⅠ熒光染料與探針相比，雖然特異性不如探針，但它能監(jiān)測任何dsDNA序列的擴(kuò)增，使檢測方法變得簡便，價(jià)格低廉，從而降低了檢測的成本，特別適用于基層單位和邊境檢疫，具有廣闊的應(yīng)用前景。

圖5 SYBR GreenⅠ熒光定量RQ－PCR的敏感性試驗(yàn)

3.3 根據(jù)溶解曲線分析，擴(kuò)增產(chǎn)物中無引物二聚體的影響，說明所設(shè)計(jì)引物特異，退火溫度合適，可為高原牦牛多殺性巴氏桿菌病的早期診斷、分子流行病學(xué)調(diào)查以及疫苗質(zhì)量的監(jiān)測等提供新的快速檢測技術(shù)，并為以后研制快速診斷試劑盒奠定相關(guān)的理論基礎(chǔ)。

3.4 據(jù)報(bào)道，熒光定量PCR可以對活體內(nèi)隱性感染的核酸含量進(jìn)行檢測［9］，另外本試驗(yàn)使用的模板DNA均是用純培養(yǎng)物提取的，是否可以用該方法直接對病料進(jìn)行檢測，是我們下一步將開展的研究。

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