新疆沙灣牛病毒性腹瀉病毒基因2型毒株的分離鑒定

王國超，王滬生，喬 軍，孟慶玲，劉昱成，楊海波，賀志昊，陳創(chuàng)夫

（1.石河子大學動物科技學院，新疆 石河子832003；2.新疆沙灣縣獸醫(yī)站，新疆 沙灣832002）

牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）屬黃病毒科（Flaviviridae）瘟病毒屬 （Pestivirus）成員，屬內(nèi)同時還包括豬瘟病毒（CSFV）、綿羊邊界病病毒（BDV）。BVDV主要引起牛的以發(fā)熱、黏膜糜爛潰瘍、白細胞減少、腹瀉、咳嗽及懷孕母牛流產(chǎn)或產(chǎn)出畸形胎兒為主要特征的一種傳染病。目前，該病在全球范圍內(nèi)廣泛流行，在養(yǎng)牛業(yè)發(fā)達的國家更為嚴重。新生牛的持續(xù)性感染常年帶毒、排毒，是畜群中主要的傳染源。當持續(xù)感染動物再次感染抗原性相關(guān)的BVDV時可會引起致死性的黏膜?。?］。同時，BVDV還是牛源生物制品（血清、凍精、胚胎、疫苗等）的潛在污染源，給畜牧業(yè)生產(chǎn)和相關(guān)產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失［2－3］。

BVDV基因組為單股正鏈RNA分子，長度約為12.3kb，5′端無“帽子”結(jié)構(gòu)，3′端無Poly（A）“尾巴”結(jié)構(gòu)，病毒基因組由 5′－UTR、開放閱讀框（ORF）和3′－UTR組成［4］。5′－UTR 序列在 BVDV基因組中有較高的保守性，利用此特性可對BVDV的感染進行分子診斷和病原基因分型。目前通常認為，根據(jù)其5′－UTR是否存在Pst1位點BVDV可分為兩種基因型，即BVDV－1和BVDV－2，不同的基因型在抗原性上存在較大差異［4］。根據(jù)其接種細胞后是否產(chǎn)生細胞病變（CPE），又可以將其分為兩種生物型，即致細胞病變型（CP）和非致細胞病變型（NCP），每種基因型同時存在這兩種生物型，兩種生物型在毒力和致病性方面沒有明顯差別［5］。為了了解在新疆是否同時存在BVDV－1和BVDV－2的感染，本研究對2012年采集沙灣縣某牛場疑似BVDV感染牛的病料進行了BVDV的檢測和分離。

1 材料與方法

1.1 細胞、菌株、毒株及試劑 MDBK 細胞、BVDV NADL標準毒株，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。宿主菌E.coli DH5α均由本實驗室保存，pMD19－T載體、反轉(zhuǎn)錄酶 M－MLV及RNA抑制劑，購自TaKaRa公司。1640高糖培養(yǎng)基、犢牛血清（經(jīng)過BVDV檢測陰性），購自美國GIBCO公司；TRIzol Reagent，購自Invitrogen公司；DNA回收試劑盒、DNA Marker、dNTP和Taq酶，購自廣州東盛生物科技有限公司。

1.2 病料采集 從新疆沙灣縣周邊某牛場采集臨床癥狀疑似BVDV感染牛的血液、糞便、腸黏膜、淋巴結(jié)、脾臟等病料15份，置于－80℃保存。

1.3 引物設(shè)計及合成 根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的BVDV 5′－UTR序列和E2基因序列選擇相對保守區(qū)域分別設(shè)計3對特異性引物，其中P1－P2用于篩查疑似病料是否為BVDV陽性，P3－P4和P5－P6分別用于BVDV基因1型和基因2型E2基因的擴增。引物及測序服務(wù)由北京華大基因公司完成。P1：5′－CCTAGCCATGCCCTTAGTAGGACT－3′；P2：5′－GGAACTCCATGTGCCATGTACA－3′。E2基因引 物 P3：5′－GGGCCAGCCTTCCAGATGGT－3′；P4：5′－TCCCCCTTTAACATGTATTG－3′。 P5：5′－GGGCCAGCCTTCCAGATGGT 3′；P6：5′－TCCCCCTTTAACATGTATTG－3′。

1.4 RT－PCR擴增及5′－UTR的克隆 參照 TRIzol說明操作提取病料總RNA，以提取的RNA為模板進行RT反應(yīng)，再以RT產(chǎn)物為模板進行5′－UTR PCR檢測。RT反應(yīng)采用20μL反應(yīng)體系：M－MLV 5 ×Buffer 5μL，dNTP（2.5μmol／L）4 μL，下游引物（20pm）1μL，RNase inhibition 1μL，M－MLV reverse enzyme 1μL，RNA－free Water 8 μL，20μL體系，混勻37℃反轉(zhuǎn)錄1h。以RT產(chǎn)物為模板，采用50μL反應(yīng)體系進行PCR擴增：10×Buffer 5μL，cDNA 5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，Taq酶0.5μL，H2O 33.5μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性4min；94℃變性50s，58℃退火40s，72℃延伸30s，40個循環(huán)；72℃延伸10min。將PCR擴增用DNA凝膠回收試劑盒回收后與載體pMD19－T連接，通過PCR和酶切進一步篩選驗證陽性克隆。將鑒定正確的重組載體送北京華大基因公司測序；用DNAMAN軟件對測序進行分析。

1.5 病毒的分離鑒定

1.5.1 樣品的處理 對于RT－PCR檢測陽性的組織病料，加入4體積的PBS緩沖液研磨，以12 000 r／min（4℃）離心15min。吸取上清液，按0.1%體積加入雙抗，混勻在4℃作用過夜，12 000r／min（4℃）離心15min吸取上清，0.22μm濾膜過濾，－80℃保存用于病毒的分離。對于RT－PCR檢測陽性的血液樣品用淋巴細胞分離液無菌分離外周血單核細胞（PBMC），吸取后置于1640培養(yǎng)液中待用。

1.5.2 病毒分離 將長成單層的MDBK細胞用PBS沖洗3遍，將處理好的病料上清液或PBMC接種MDBK單層細胞，置于37℃、5%CO2吸附2h，然后加入1640細胞維持液（含2%犢牛血清），每日觀察細胞3次，同時設(shè)立正常細胞和接種NADL毒株細胞作對照。連續(xù)盲傳5代，觀察是否出現(xiàn)細胞病變（CPE）。待出現(xiàn)CPE時，反復(fù)凍融3次后，培養(yǎng)液用2%磷鎢酸負染后電鏡觀察。

1.5.3 BVDV－SW 分離株 E2基因的擴增、克隆、遺傳進化分析 用TRIzol提取BVDV－SW 株總RNA，分別用BVDV基因1型和基因2型E2基因特異性引物P3－P4和P5－P6進行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件均為：95℃預(yù)變性4min；94℃變性40s，52℃退火50s，72℃延伸90s，40個循環(huán)；72℃延伸10min。將擴增出來的目的片段回收后與pMD19－T載體連接，轉(zhuǎn)化克隆后挑取單菌落，做菌液PCR篩選，篩選陽性轉(zhuǎn)化子進行測序分析。用MEGA5.0軟件（Phylogeny／Bootstrap test of phylogeny／neighbor－joining，Bootstrap 重 復(fù) 次 數(shù) 為1 000次）構(gòu)建E2基因的遺傳進化樹。

2 結(jié)果

2.1 病料檢測結(jié)果 利用5′－UTR引物對15份病料進行RT－PCR檢測，結(jié)果有4份樣品（其中2份為糞便樣品，2份為血液樣品）擴增出與預(yù)期值相符的293bp的目的片段（圖1）。目的片段克隆入T載體后，用PCR方法篩選重組菌（圖2）并進行測序，結(jié)果從樣品擴增出的5′－UTR 與 BVDV－2 5′－UTR同源性為99.2%，證實疑似病料確實屬于BVDV感染。

圖1 5′UTR PCR擴增

圖2 陽性重組菌液的PCR鑒定

2.2 病毒分離結(jié)果 當盲傳傳至第4代時，MDBK出現(xiàn)規(guī)律性的細胞病變（CPE）（圖3），主要表現(xiàn)為：梭狀或三角狀細胞開始變圓，部分細胞開始脫落，漂浮在維持液中；在瓶壁上呈現(xiàn)拉網(wǎng)狀，胞漿中出現(xiàn)大小不等的空泡，細胞碎片漂浮在液面上。在產(chǎn)生細胞病變的培養(yǎng)液負染后電鏡觀察到球形、有囊膜、直徑約為50～60nm、囊膜表面有突起的病毒粒子，形態(tài)結(jié)構(gòu)與BVDV顆粒相符（分離株命名為BVDV－SW）。

圖3 BVDV－SW分離株在MDBK細胞上引起的細胞病變

2.3 BVDV－SW分離毒株E2基因的擴增、克隆與序列分析 測序結(jié)果分析顯示，BVDV－SW分離株E2基因與NADL（屬于BVDV－1）參考株的同源性為67.05%，與BVDV890、XJ－04參考株同源性分別為82.36%和84.36%，經(jīng)過Nucleotide blast分析后，與BVDV－2型同源性比較高，屬于BVDV－2型。

圖4 E2基因PCR擴增

2.4 BVDV E2基因系統(tǒng)進化分析 將分離株BVDV－SW的E2蛋白基因與GenBank發(fā)表的BVDV基因1型標準毒株和基因2型標準毒株及其他參考毒株進行系統(tǒng)進化樹分析（圖6），結(jié)果顯示：進化樹明顯分成兩個分支，分離株BVDV－SW 和17237（BVDV－2型，分離于歐洲）聚為一個小分支，與C24V、NADL（均屬于BVDV－1型）標準株的親緣關(guān)系均較遠；BVDV－SW與XJ－04毒株關(guān)系較近，同源率較高。

圖5 E2基因重組菌液的PCR鑒定

圖6 基于BVDV E2基因的系統(tǒng)進化分析

3 討論與小結(jié)

近年來，隨著新疆畜牧業(yè)的快速發(fā)展，BVDV在動物血清中陽性率較高。王治才等對新疆7個地區(qū)羔羊作了BVDV的感染調(diào)查，平均陽性率為73.6%［6］。鐘發(fā)剛等通過對2006年～2008年新疆7個地區(qū)15個牛場472份全血樣品進行了RTPCR檢測，發(fā)現(xiàn)42%的樣品為陽性［7］，證實該病在新疆牛羊中廣泛流行。為了科學防控本病，目前有必要開展該病的分子流行病學調(diào)查和病原的分離鑒定研究。

用于BVDV的分離的病料可采用疑似BVDV感染牛的血液、糞便、腸黏膜、淋巴結(jié)和脾臟等［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，采用發(fā)病牛血液從中分離出外周血單核細胞（PBMC）較易分離出BVDV。在發(fā)病牛糞便中雖然可以檢測到大量的病毒粒子，但由于糞便中存在有毒物質(zhì)，會影響細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，易造成CPE假象，所以糞便樣品適合作為RT－PCR檢測對象而不適合作為分離病毒的材料。另外，有研究證實牛源細胞、血清及其相關(guān)制品、凍精本身存在BVDV污染，因此在分離BVDV時要先檢測分離所用的細胞和血清本身是否存在BVDV污染［9］。

現(xiàn)有的研究資料顯示，目前國內(nèi)分離鑒定的毒株以BVDV－1占優(yōu)勢地位，BVDV－2流行較少，而BVDV－2主要流行于南美、北美以及一些歐洲國家。然而隨著國際畜禽貿(mào)易活動的增加，近幾年亞洲國家也分離到了一些 BVDV－2流行毒株［10－12］，我國也有分離到 BVDV－2毒株的報道［13－14］。鐘發(fā)剛等通過對新疆7個地區(qū)472份全血樣品中RT－PCR檢測為陽性的24份樣品擴增出的5′－UTR測序比較發(fā)現(xiàn)，BVDV流行株基因型主要為BVDV－1b（18份）和BVDV－1c（6份），而沒有檢測到BVDV－2的感染［7］。然而，本研究證實目前在新疆某些奶牛場牛群中存在BVDV－2感染，并且流行毒株具有較強的致病力，推測這可能與近幾年日益頻繁的國內(nèi)外畜禽貿(mào)易活動有關(guān)。本研究為新疆奶牛BVDV的科學防控提供了一定的理論依據(jù)。

［1］Brock K V.The persistence of bovine viral diarrhea virus［J］.Biologicals，2003，31（2）：133－135.

［2］Makoschey B，van Gelder P T，Keijsers V，et al.Bovine viral diarrhoea virus antigen in foetal calf serum batches and consequences of such contamination for vaccine production［J］.Biologicals，2003，31（3）：203－208.

［3］朱禮倩，周艷君，于海，等.牛病毒性腹瀉在中國的流行現(xiàn)狀分析［J］.中國動物傳染病學報，2011，19（5）：83－86.

［4］Vilcek S，Paton D J，Durkovic B，et al.Bovine viral diarrhoea virus genotype 1can be separated into at least eleven genetic groups［J］.Arch Virol，2001，146（1）：99－115.

［5］Lee S R，Nanduri B，Pharr G T，et al.Bovine viral diarrhea virus infection affects the expression of proteins related to professional antigen presentation in bovine monocytes［J］.Biochim Biophys Acta，2009，1794（1）：14－22.

［6］王治才，劉崇向，趙澤森，等.牛腹瀉病毒感染羔羊的調(diào)查［J］.中國畜禽傳染病，1992，64（3）：41－42

［7］Zhong F，Li N，Huang X，et al.Genetic typing and epidemiologic observation of bovine viral diarrhea virus in Western China［J］.Virus Genes，2011，42（2）：204－207.

［8］Ciulli S，Galletti E，Battilani M，et al.Genetic typing of bovine viral diarrhoea virus：evidence of an increasing number of variants in Italy［J］.New Microbiol，2008，31（2）：263－271.

［9］Liu H，Li Y，Gao M，et al.Complete genome sequence of a bovine viral diarrhea virus 2from commercial fetal bovine serum［J］.J Virol，2012，86（18）：10233.

［10］Matsuno K，Sakoda Y，Kameyama K，et al.Genetic and pathobiological characterization of bovine viral diarrhea viruses recently isolated from cattle in Japan［J］.J Vet Med Sci，2007，69（5）：515－520.

［11］Behera S P，Mishra N，Vilcek S，et al.Genetic and antigenic characterization of bovine viral diarrhoea virus type 2isolated from cattle in India［J］.Comp Immunol Microbiol Infect Dis，2011，34（2）：189－196.

［12］Mishra N，Pattnaik B，Vilcek S，et al.Genetic typing of bovine viral diarrhoea virus isolates from India［J］.Vet Microbiol，2004，104（3－4）：207－212.

［13］李慶超，苗利光，李海濤，等.中國牛病毒性腹瀉病毒JZ05－1分離株全基因測序及分析［J］.病毒學報，2010，26（3）：238－243.

［14］Tao J，Wang Y，Wang J，et al.Identification and genetic characterization of newbovine viral diarrhea virus genotype 2 strains in pigs isolated in China［J］.Virus Genes，2012Oct 21.