KPC1和胞質(zhì)p27Kip1在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及臨床意義

吳愛(ài)民，韓云，陳燕，周紅

(南通市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇南通226001)

卵巢癌是婦科最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌，但死亡率卻超過(guò)了后兩者之和，嚴(yán)重威脅女性的健康。p27Kip1是細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶(CDK)抑制蛋白之一，在細(xì)胞核中能夠與細(xì)胞周期蛋白E-CDK2結(jié)合，發(fā)揮阻滯細(xì)胞周期的作用［1］，作用于包括卵巢癌在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞［2］。已有研究顯示，胞質(zhì)中的p27Kip1與卵巢癌的不良預(yù)后相關(guān)［3］。Kip1泛素-促進(jìn)復(fù)合體 1(Kip1 ubiquitination-promoting complex，KPC1)是一種E3泛素酶復(fù)合體亞基之一，能夠降解從胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至胞質(zhì)中的 p27Kip1［4］。

本研究擬采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)卵巢癌組織中KPC1和胞質(zhì)p27Kip1的表達(dá)情況，并分析其表達(dá)與患者臨床病理因素之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 組織標(biāo)本

收集2008年1月至2011年12月于我院婦產(chǎn)科行手術(shù)切除，經(jīng)病理證實(shí)、甲醛固定、石蠟包埋的卵巢癌切片標(biāo)本64例;患者年齡32～77歲(平均61歲)，術(shù)前均未做任何輔助性治療。病理資料如下:高分化14例，中分化31例，低分化19例;漿液性癌36例，黏液性癌14例，子宮內(nèi)膜樣腺癌8例，透明細(xì)胞癌6例;發(fā)生轉(zhuǎn)移40例，未發(fā)生轉(zhuǎn)移24例;有腹腔積液21例，無(wú)腹腔積液43例。

1.2 抗體

兔抗人p27Kip1多克隆抗體購(gòu)自 Santa Cruz公司，鼠抗人KPC1單克隆抗體購(gòu)自Abcam公司，二抗及DAB顯色試劑盒購(gòu)自Dako公司。

1.3 免疫組織化學(xué)分析

病理組織切片置于60℃烤箱烘烤6～8 h，然后經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇(濃度由高到低)水化后，高壓鍋檸檬酸鹽(pH=6.0)修復(fù)抗原。室溫孵育一抗(KPC1，1 ∶100;p27Kip1，1 ∶500)2 h，洗滌。室溫孵育二抗30 min，DAB顯色液顯色5 min，自來(lái)水沖洗終止反應(yīng)。蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，鹽酸乙醇脫色。梯度乙醇(濃度由低到高)脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 免疫組織化學(xué)評(píng)分

采用Leica正置顯微鏡拍攝。切片陽(yáng)性表現(xiàn)為細(xì)胞核和(或)細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒，陰性對(duì)照則無(wú)棕黃色反應(yīng)物出現(xiàn)，僅僅細(xì)胞核染成藍(lán)紫色。所有切片評(píng)價(jià)由筆者和兩位未知患者資料的病理專(zhuān)家獨(dú)立進(jìn)行，三者評(píng)價(jià)綜合考慮作為該切片的染色分級(jí)。

KPC1陽(yáng)性表現(xiàn)為廣泛胞質(zhì)著色。根據(jù)切片的染色深度分為不同的等級(jí):0，無(wú)著色;1，輕度著色;2，中度著色;3，重度著色。0和1為低表達(dá)，2和3為高表達(dá)。計(jì)數(shù)方法:每張切片選取5個(gè)有代表性的高倍鏡視野(400×)，向同一個(gè)方向移動(dòng)切片，不重復(fù)，不重疊。

p27Kip1陽(yáng)性表現(xiàn)為細(xì)胞核和(或)細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒。評(píng)分按照陰性、核染和質(zhì)染3種計(jì)算。胞質(zhì)和胞核染色分開(kāi)評(píng)分，不疊加。計(jì)數(shù)方法:每張切片選取5個(gè)有代表性的高倍鏡視野(400×)，向同一個(gè)方向移動(dòng)切片，不重復(fù)，不重疊，每個(gè)視野隨機(jī)計(jì)數(shù)300個(gè)腫瘤細(xì)胞，共計(jì)算1 500個(gè)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的陽(yáng)性細(xì)胞百分率。陰性定義為胞質(zhì)不著色，陽(yáng)性核＜5%;胞質(zhì)染色分級(jí)同KPC1;當(dāng)染色出現(xiàn)在胞核而不在胞質(zhì)時(shí)，切片定義為“僅僅核染”。核染色定義 ＞5%為高表達(dá)，＜5%為低表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)采用 Pearson χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。采用Spearman相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌組織中KPC1和胞質(zhì)p27Kip1的表達(dá)

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，KPC1呈胞質(zhì)定位，低分化組織內(nèi)可見(jiàn)密集棕黃色顆粒，呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá);中分化組織內(nèi)可見(jiàn)較多棕黃色顆粒，KPC1呈中等陽(yáng)性表達(dá);高分化組織內(nèi)可見(jiàn)彌散分布的棕黃色顆粒，KPC1呈弱陽(yáng)性表達(dá)。p27Kip1散在分布于組織切片內(nèi)，呈胞核和(或)胞質(zhì)定位，高分化組織中p27Kip1主要是胞核著色，胞質(zhì)少見(jiàn)著色，而低分化組織中明顯見(jiàn)到胞質(zhì)著色。從不同組織病理類(lèi)型來(lái)看，p27Kip1和KPC1在漿液性癌、黏液性癌及子宮內(nèi)膜樣癌中表達(dá)明顯，而在透明細(xì)胞癌中幾乎無(wú)表達(dá)。見(jiàn)圖1和圖2。

2.2 KPC1及胞質(zhì)p27Kip1的表達(dá)與臨床病理因素的相關(guān)性

如表1所示，KPC1表達(dá)與FIGO分期、腫瘤分化程度、病理類(lèi)型、轉(zhuǎn)移情況相關(guān)(P均＜0.05)，而與年齡、腫瘤殘?jiān)?、腹腔積液等無(wú)相關(guān)性(P均＞0.05)。胞質(zhì)p27Kip1的表達(dá)與患者的FIGO分期、腫瘤分化程度、病理類(lèi)型相關(guān)(P均＜0.05)，而與年齡、轉(zhuǎn)移情況、腫瘤殘?jiān)?、腹腔積液等無(wú)相關(guān)性(P＞均0.05)。

圖1 KPC1和p27Kip1在不同分化癌組織中的表達(dá)(400×)Fig 1 The expressions of KPC1 and p27Kip1in various differentiated neoplasm

圖2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)KPC1和p27Kip1在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)(400×)Fig 2 Immunohistochemical analysis of KPC1 and p27Kip1expression in epithelial ovarian cancer

表1 KPC1和胞質(zhì)p27Kip1的表達(dá)與上皮性卵巢癌臨床病理參數(shù)間的關(guān)系Tab 1 The relationship between the expression of KPC1 and cytoplasmic p27Kip1 and the clinical pathological parameters of epithelial ovarian cancer

2.3 KPC1與胞質(zhì)p27Kip1的相關(guān)性

KPC1和胞質(zhì) p27Kip1屬于等級(jí)資料，采用Spearman相關(guān)分析顯示，KPC1與胞質(zhì)p27Kip1表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.493，P ＜0.01)。

3 討論

細(xì)胞周期紊亂是癌癥進(jìn)程中的首要事件。p27Kip1作為一種CDK抑制蛋白，能夠阻滯細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期［1］，并且其表達(dá)丟失與各種腫瘤的進(jìn)程有密切關(guān)系。p27Kip1轉(zhuǎn)運(yùn)至胞核外往往失去了周期抑制作用。在卵巢癌中，胞質(zhì)亞細(xì)胞定位的p27Kip1在漿液組織中表達(dá)多于黏液組織。多因素生存分析顯示，胞質(zhì)p27Kip1而不是胞核p27Kip1，是獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)［3］。本研究檢測(cè)了不同病理標(biāo)本中p27Kip1的表達(dá)，結(jié)果顯示，胞質(zhì)p27Kip1在低分化組織中的表達(dá)較高分化組織高，其表達(dá)與腫瘤分化程度相關(guān)(P＜0.05)，與之前的研究結(jié)果一致［5］。

本研究結(jié)果表明，KPC1在卵巢癌細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，腫瘤分化程度越低其表達(dá)深度越強(qiáng)。病理因素分析結(jié)果顯示，KPC1與FIGO分期、腫瘤病理類(lèi)型等因素有關(guān)(P均＜0.01)。此外，Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，KPC1與胞質(zhì)p27Kip1表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.493，P ＜0.01)。上述結(jié)果提示，KPC1 與胞質(zhì)中p27Kip1呈共表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞處于G1期時(shí)，有絲分裂信號(hào)刺激p27Kip1Ser10磷酸化，然后借助Jab1/CRM1由核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至胞質(zhì)［6－7］;進(jìn)而被一種未確定的E3泛素酶復(fù)合物泛素化，經(jīng)由蛋白酶體降解。而在S期和G2期，胞核中周期蛋白 E-CDK2刺激p27Kip1Thr187磷酸化，SCFskp2使其泛素化，最后由蛋白酶體降解［8］。Kamura 等［4］發(fā)現(xiàn)，E3 復(fù)合體命名為Kip1泛素-促進(jìn)復(fù)合體，由KPC1和KPC2兩個(gè)亞基組成。KPC1是催化亞基，其羧基端環(huán)指結(jié)構(gòu)域能夠與胞質(zhì) p27Kip1相互作用，促進(jìn) p27Kip1泛素化［9］。KPC2發(fā)揮銜接蛋白的作用，參與p27Kip1多聚泛素化與26S蛋白酶體的傳遞［10］。機(jī)體內(nèi) p27Kip1的 mRNA表達(dá)在增殖細(xì)胞的整個(gè)細(xì)胞周期是恒定的，基于翻譯后修飾的調(diào)節(jié)作用，其蛋白水平因所處周期的不同而不同。分化程度越高，胞核內(nèi)Ser10發(fā)生磷酸化的p27Kip1表達(dá)越多，致使其出核轉(zhuǎn)運(yùn)增加，進(jìn)而引起胞質(zhì)中p27Kip1表達(dá)增加。胞質(zhì)中p27Kip1在Tyr74和Tyr78發(fā)生磷酸化后重新進(jìn)入胞核，而KPC1促進(jìn)胞質(zhì)p27Kip1泛素化降解，負(fù)反饋抑制入核，擾亂了出入核平衡，從而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞異常增殖。

本研究綜合考查了胞質(zhì)p27Kip1與其降解蛋白KPC1的表達(dá)關(guān)系。研究結(jié)果提示，二者共表達(dá)的上皮性卵巢癌組織的分化程度差，病情嚴(yán)重。

［1］ Sgambato A，Cittadini A，F(xiàn)araglia B，et al.Multiple functions of p27Kip1and its alterations in tumor cells:a review［J］.J Cell Physiol，2000，183(1):18 －27.

［2］ Radu M，Soprano DR，Soprano KJ.S10 phosphorylation of p27 mediates atRA induced growth arrest in ovarian carcinoma cell lines［J］.J Cell Physiol，2008，217(2):558－568.

［3］ Duncan TJ，Al-Attar A，Rolland P，et al.Cytoplasmic p27 expression is an independent prognostic factor in ovarian cancer［J］.Int J Gynecol Pathol，2010，29(1):8－18.

［4］ Kamura T，Hara T，Matsumoto M，et al.Cytoplasmic ubiquitin ligase KPC regulates proteolysis of p27Kip1at G1 phase［J］.Nat Cell Biol，2004，6(12):1229 －1235.

［5］ Kruck S，Merseburger AS，Hennenlotter J，et al.High cytoplasmic expression of p27Kip1is associated with a worse cancer-specific survival in clear cell renal cell carcinoma［J］.BJU Int，2012，109(10):1565 －1570.

［6］ Pan Y，Zhang Q，Tian L，et al.Jab1/CSN5 negatively regulates p27 and plays a role in the pathogenesis of nasopharyngeal carcinoma［J］.Cancer Res，2012，72(7):1890－1900.

［7］ Connor MK，Kotchetkov R，Cariou S，et al.CRM1/Ran-mediated nuclear export of p27Kip1involves a nuclear export signal and links p27 export and proteolysis［J］.Mol Biol Cell，2003，14(1):201 －213.

［8］ Iwahori S，Murata T，Kudoh A，et al.Phosphorylation of p27Kip1by Epstein-Barr virus protein kinase induces its degradation through SCFSkp2ubiquitin ligase actions during viral lytic replication［J］.J Biol Chem，2009，284(28):18923－18931.

［9］ Lu Y，Adegoke OA，Nepveu A，et al.USP19 deubiquitinating enzyme supports cell proliferation by stabilizing KPC1，a ubiquitin ligase for p27Kip1［J］.Mol Cell Biol，2009，29(2):547 －558.

［10］ Hara T，Kamura T，Kotoshiba S，et al.Role of the UBL-UBA protein KPC2 in degradation of p27 at G1 phase of the cell cycle［J］.Mol Cell Biol，2005，25(21):9292－9303.