雙黃乳膏不同皮膚體外擴散的實驗研究

王 敏 趙 婷 龔慕辛 尚雅文 張 超

(首都醫(yī)科大學，北京，100069)

雙黃乳膏是由黃連、黃柏等組成的外用乳膏，具有清熱解毒、消炎止痛作用，主要用于各種肌腱扭傷、挫傷所致之紅腫熱痛。本實驗就透皮吸收促進劑－氮酮用量對有效成分鹽酸小檗堿體外經(jīng)皮滲透的影響進行考察，為進一步篩選處方做準備。有關(guān)雙黃巴布劑中鹽酸小檗堿透皮吸收的研究已有報道[1－2]，但均采用大鼠皮，本實驗利用蛇蛻、小鼠皮膚研究體外經(jīng)皮擴散的情況。

1 材料與儀器

1.1 材料與試藥 黃連、黃柏等飲片70%醇提物(自制)，氯化鈉(北京化工廠，批號20021122)，羊毛脂(北京市昌平石鷹化工廠，991102)，液體石蠟(北京求賢化工試劑廠，批號211003021)，月桂氮酮(北京化學試劑公司，批號041202)，尼泊金乙酯(中國醫(yī)藥公司北京采購供應站，批號910709)，三乙醇胺(北京化學試劑工廠，批號930901)，硬脂酸(北京益利精細化學品有限公司，批號20000717)，甘油(北京市嘉利佳工貿(mào)有限公司)，蒸餾水。烏梢蛇蛇蛻(整條，購于安國藥市);雄性ICR小鼠(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證編號:SCXK(京)2006－0009)。

1.2 儀器 智能透皮試驗儀(YB－P6，天津市富蘭斯電子科貿(mào)有限公司)，超聲波清洗機(KQ－500，昆山市超聲儀器有限公司)，紫外分光光度計(UV－1800PC，上海美普達儀器有限公司)，電動脫毛器(市購)。

2 方法

2.1 雙黃乳膏的制備 取硬脂酸6.13 g、液體石蠟10 mL、羊毛脂1.12 g，氮酮(乳膏A加1 mL，乳膏B加4 mL)置小燒杯中，在75℃水浴加熱并攪拌使其熔化，備用。另取尼泊金乙酯0.2 g溶于甘油2 mL與三乙醇胺2 mL、適量水和制成水相，水浴加熱至75℃，備用，將油相緩慢加入水相中，邊加邊沿同一方向用玻璃棒充分攪拌，使充分乳化成稠膏狀，加入適量藥物70%乙醇提取浸膏研勻，即得含藥物浸膏5%的乳膏A、B。

2.2 標準曲線的制備 精密稱取鹽酸小檗堿5.0 mg，用0.9%的氯化鈉溶液溶解，置于100 mL容量瓶內(nèi)定容，制成濃度為0.05 mg/mL對照品母液，分別吸取不同量母液于10 mL容量瓶內(nèi)，配制成濃度依次為0.045、0.02、0.01、0.005、0.001 mg/mL 的對照品溶液，后分別取不同量濃度為0.005 mg/mL的對照品溶液置于10 mL容量瓶內(nèi)，配制成濃度依次為0.000 5、0.000 2、0.000 1 mg/mL的對照品溶液。將此8個濃度的對照品溶液用紫外分光光度計于265 nm處測定吸光度，作線性擬合，求出標準曲線方程為 Y=61.588X+0.004 4，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9，說明鹽酸小檗堿濃度在0.000 1 mg/mL至0.045 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 滲透試驗用皮膚的處理

2.3.1 蛇蛻的處理 蛇蛻背部剪成適當大小，用生理鹽水洗凈并浸泡30 min后，用濾紙吸干表面水分，備用。

2.3.2 鼠皮的處理 取健康雄性ICR小鼠(30±2)g，斷脊髓處死，立即剪取背部、腹部皮膚，取下背部、腹部皮膚，先用手術(shù)剪剪去長毛，然后再用自動脫毛器剃凈剩余的短毛。仔細剝離皮下脂肪層和結(jié)締組織，用生理鹽水沖洗干凈，置生理鹽水中，低溫冰箱保存?zhèn)溆谩嶒炃白匀唤鈨?，并用濾紙吸干后使用。

2.4 經(jīng)皮擴散操作方法 采用改良擴散池[3]，暴露皮膚面積為1.668 cm2，接收池容積為16.4 mL。接收池內(nèi)放入小轉(zhuǎn)子，將剪好的完整蛇蛻、鼠腹皮、鼠背皮及固定在智能透皮試驗儀的擴散池與接收池之間，用夾子固定好，角質(zhì)層向上，真皮一側(cè)與接收液相貼。用減重法精稱雙黃乳膏(A/B)0.5 g均勻、嚴密涂于擴散池暴露的皮膚表面。設(shè)定智能透皮試驗儀的條件:溫度37℃，水浴保持恒溫，轉(zhuǎn)速500 r/min(小轉(zhuǎn)子的)。分別在放入后的 0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h從接收池精密取2.0 mL釋放液，并立即補充等量恒溫的生理鹽水。

2.5 含量測定方法 以生理鹽水作空白對照，釋放液立即在265 nm處測定吸光度，記錄實驗數(shù)據(jù)。濃度較大超出紫外量程的，進行稀釋后測定。每組平行操作6次。以樣品液吸光度代入回歸方程求出樣品中鹽酸小檗堿的含量，得到累積透過量。Qn=Cn×V+Vr×其中，Cn表示第n個時間點的接收液藥物濃度(mg/mL)，V表示接收池內(nèi)生理鹽水體積(V=16.4 mL)，Vr表示取樣體積(V=2 mL)，Ci為第i個時間點的接收液藥物濃度(mg/mL)，i=n－1。計算出累積透皮吸收量Q(mg)。

3 結(jié)果

1)雙黃乳膏A與雙黃乳膏B經(jīng)蛇蛻和鼠皮透皮釋放不同時間累積量見表1。

表1 不同濃度氮酮乳膏鹽酸小檗堿累積透過量(Q±SD，μg，n=6)

表2 不同濃度氮酮乳膏鹽酸小檗堿經(jīng)皮擴散速率(μg/h，n=6)

2)雙黃乳膏A與B經(jīng)蛇蛻和鼠皮不同時間的累積透過量經(jīng)線性回歸，直線的斜率即經(jīng)皮擴散速率(μg/h)，回歸方程及相關(guān)系數(shù)r見表2。截距為負值即表示藥物經(jīng)皮吸收有擴散時滯。

3)由表1可以看出:A乳膏鹽酸小檗堿累積透過量，小鼠腹皮是蛇蛻的15倍，小鼠背皮是蛇蛻的16倍;B乳膏鹽酸小檗堿累積透過量，小鼠腹皮是蛇蛻的31倍，小鼠背皮是蛇蛻的44倍。累積透過量為小鼠背皮＞小鼠腹皮＞蛇蛻。用小鼠腹部和背部皮膚進行經(jīng)皮擴散試驗，雖然A乳膏累積透過量均呈現(xiàn)大于B乳膏的趨勢，但結(jié)果無統(tǒng)計學意義。采用蛇蛻時，A乳膏累積透過量大于B乳膏，結(jié)果有統(tǒng)計學意義(P=0.037)。

4 討論

氮酮為目前使用較多的促透劑，用量小、無毒且對皮膚的刺激性很低，對親水性或疏水性化合物均有較強的透皮吸收促進作用[4－5]，使用濃度為 0.1% ～10%，常用濃度為0.5% ～2%[6]。前人研究發(fā)現(xiàn)氮酮對不同藥物的透皮吸收影響不同，其用量并非越高越好，故對試驗藥物應選擇最佳用量[7－8]。本試驗考察了兩種不同濃度的氮酮對于雙黃乳膏12 h累積透過量和經(jīng)皮擴散速率的影響，發(fā)現(xiàn)蛇蛻無論從累積透過量還是經(jīng)皮擴散速率均能較好地區(qū)分兩者的差異，證明氮酮含量4%的乳膏中有效成分透皮吸收量和速率均低于氮酮含量1%的乳膏。而小鼠無論背皮還是腹皮試驗結(jié)果雖能看出氮酮含量4%的乳膏透皮存在時滯，但從累積透過量看差異無統(tǒng)計學意義，對兩者的區(qū)分度不佳。透皮吸收研究中實驗皮膚的選擇對預測藥物的透皮特性有重要意義，目前認為小豬、猴和蛇蛻等與人皮膚較為相似[9]，但由于皮膚來源的關(guān)系，大鼠、小鼠和兔皮仍常用作透皮吸收實驗皮膚，豚鼠皮也偶見報道[6]。本試驗也說明透皮吸收試驗選取皮膚不同，會影響試驗的結(jié)論。分析其原因如下。

蛇蛻是一種無毛囊的純角質(zhì)層，厚度為10～20 μm，分β層(以β角蛋白為主)、中層(以α角蛋白和類脂為主)和α層(以α角蛋白為主)。β層對透過性影響不大，中層與α層是透過的主要屏障，中層結(jié)構(gòu)與人角質(zhì)層極相似，因此在結(jié)構(gòu)、組成、脂類含量、水分滲透性等方面與人類表皮角質(zhì)層類似。據(jù)文獻報道，藥物透過蛇蛻的滲透系數(shù)與其透過人皮的滲透系數(shù)相似或常略低，而其它動物表皮的滲透系數(shù)則遠大于人皮膚[10－11]。有實驗表明氮酮對蛇蛻的促透作用比小鼠皮更顯著，認為其主要作用部位可能是角質(zhì)層[12]，這可能是采用蛇蛻做透過試驗對氮酮含量差異更敏感的原因之一。其次，蛇蛻表皮為一個完整薄層，能夠制備多個樣品;單個動物也可提供多次蛻皮，從而消除個體差異;蛻皮可在室溫下保存。蛇蛻缺少毛囊，可以避免經(jīng)毛囊路徑的滲透，實驗結(jié)果穩(wěn)定，個體差異小，容易比出差異。而小鼠的皮膚由于存在毛囊，在制備鼠皮時需要進行剃毛等操作，容易發(fā)生肉眼難以發(fā)現(xiàn)的皮膚損傷或剃毛不凈[11]，且同只小鼠可制備的皮張數(shù)量受到限制，因此引入較大的個體差異，實驗結(jié)果不易穩(wěn)定[13]，難以比出差異。故蛇蛻作為體外透皮實驗的擴散膜其實驗數(shù)據(jù)會更有實際意義。因此，建議在進行透皮試驗時，應根據(jù)試驗目的選擇適宜的皮膚[14]。

此外，根據(jù)多次試驗發(fā)現(xiàn)，小鼠背部毛遠遠多于腹部，且背部皮膚較厚，皮下脂肪層和結(jié)締組織較難去凈[15];小鼠腹部皮膚毛少，較薄，皮下結(jié)締組織較易去凈，實驗結(jié)果相比與背部皮膚更穩(wěn)定，差異較小。因此，小鼠腹部皮膚更適宜于做透皮吸收試驗。

本試驗選取蛇蛻進行體外透皮試驗，并與常用的小鼠背皮與腹皮進行了結(jié)果的對比，試驗結(jié)果可以為雙黃乳膏不同處方經(jīng)人體透皮的差異提供參考。

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