應(yīng)激對(duì)裸鼠胰腺癌生長(zhǎng)的影響

任風(fēng)梅，劉珍紅，李玉軍

（1 青島市城陽(yáng)區(qū)人民醫(yī)院病理科，山東 青島 266019； 2 即墨市中醫(yī)醫(yī)院特檢科； 3 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科）

近幾年來(lái)，盡管惡性腫瘤的治療取得很大的進(jìn)展，但對(duì)胰腺癌仍缺乏有效治療手段，病人生存率未見(jiàn)明顯提高。大部分病人確診時(shí)往往已有轉(zhuǎn)移，屬臨床晚期，心理恐懼和軀體疼痛必然導(dǎo)致機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)，使體內(nèi)腎上腺素和去甲腎上腺素水平增高。本實(shí)驗(yàn)旨在建立裸鼠胰腺癌束縛應(yīng)激模型，模擬人類(lèi)應(yīng)激狀態(tài)，通過(guò)檢測(cè)移植瘤組織中細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子（EMMPRIN）、細(xì)胞增殖相關(guān)抗原（Ki－67）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、微血管密度（MVD）和內(nèi)皮細(xì)胞增殖相關(guān)抗原（CD105）的表達(dá)情況，探討應(yīng)激促進(jìn)裸鼠胰腺癌移植瘤生長(zhǎng)的機(jī)制，為胰腺癌的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

取雄性 BALB／C（nu／nu）裸鼠20只，4～6周齡，體質(zhì)量為15～18 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司；人胰腺癌細(xì)胞株panc－1由中國(guó)協(xié)和醫(yī)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。檢測(cè)所需VEGF抗體、CD105抗體、EMMPRIN抗體、Ki－67抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分組與處理 以含體積分?jǐn)?shù)0.75乙醇的棉球消毒裸鼠皮膚，將（1～2）×107的人胰腺癌細(xì)胞株panc－1單細(xì)胞懸液（0.3 mL）接種于裸鼠右肩背部皮下，建立皮下移植瘤模型。隨機(jī)分為荷瘤＋應(yīng)激組和單純荷瘤組。荷瘤＋應(yīng)激組裸鼠束縛于自制束縛筒中，裸鼠在其中僅為活動(dòng)受限，束縛筒對(duì)軀體及尾部均無(wú)壓迫，具體的實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)［1］。單純荷瘤組正常喂養(yǎng)，不做處理。

1.2.2 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法 觀察各組裸鼠生長(zhǎng)狀態(tài)，處死前測(cè)量體質(zhì)量并采血，－20℃保存?zhèn)溆?。裸鼠處死后分別取出腫瘤瘤體，剝離干凈后，以濾紙拭凈血污，電子天平稱(chēng)取瘤質(zhì)量。計(jì)算腫瘤體積［2］及腫瘤生長(zhǎng)率［3］。采用ELISA法檢測(cè)裸鼠血清腎上腺素的含量。采用PV－6000法檢測(cè)裸鼠移植瘤組織中 EMMPRIN、Ki－67、VEGF、MVD 和 CD105的表達(dá)。MVD計(jì)數(shù)參照文獻(xiàn)［1］的方法，即于低倍鏡下觀察CD105染色陽(yáng)性的血管，選取腫瘤MVD最高區(qū)域，然后在高倍鏡下（200倍）選取5個(gè)不重復(fù)視野分別進(jìn)行計(jì)數(shù)，求其平均數(shù)即作為該標(biāo)本的MVD值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用PPMS 1.5統(tǒng)計(jì)軟件［4］進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示，數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 兩組裸鼠體質(zhì)量、移植瘤情況比較

實(shí)驗(yàn)前兩組裸鼠體質(zhì)量比較，差異無(wú)顯著性（P＞0.05），單純荷瘤組實(shí)驗(yàn)后體質(zhì)量明顯大于荷瘤＋應(yīng)激組，差異有顯著性（t＝2.713，P＜0.05）。與單純荷瘤組裸鼠相比較，荷瘤＋應(yīng)激組腫瘤體積明顯增大（t＝－2.486，P＜0.05）、瘤質(zhì)量明顯增加（t＝－2.685，P＜0.05）。見(jiàn)表1。荷瘤＋應(yīng)激組腫瘤生長(zhǎng)率為51.04%。

表1 慢性束縛應(yīng)激對(duì)裸鼠體質(zhì)量及移植瘤的影響（±s）

表1 慢性束縛應(yīng)激對(duì)裸鼠體質(zhì)量及移植瘤的影響（±s）

組 別 n 實(shí)驗(yàn)前體質(zhì)量（m／g） 實(shí)驗(yàn)后體質(zhì)量（m／g） 腫瘤體積（V／mm3） 瘤質(zhì)量（m／g）單 純 荷 瘤 組 10 15.76±2.07 21.78±1.40 190.48±160.70 0.96±0.41荷瘤＋應(yīng)激組 10 15.67±2.22 20.26±1.10 387.87±192.90 1.45±0.42

2.2 血清腎上腺素含量

荷瘤＋應(yīng)激組、單純荷瘤組裸鼠血清腎上腺素含量分別為（75.68±23.98）、（52.97±8.76）μg／L，兩組比較差異有顯著性（t＝－2.812，P＜0.05）。

2.3 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)

荷瘤＋應(yīng)激組裸鼠移植瘤組織中EMMPRIN、Ki－67和VEGF的陽(yáng)性表達(dá)均明顯高于單純荷瘤組，差異均有顯著意義（Z＝－2.636～－2.033，P＜0.05）。荷瘤＋應(yīng)激組MVD平均值為23.58±2.93，單純荷瘤組MVD平均值為20.64±1.44，兩組比較差異有顯著性（t＝－2.846，P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 兩組裸鼠移植瘤組織中EMMPRIN、Ki－67、VEGF的表達(dá)（只）

2.4 各指標(biāo)的相關(guān)性

移植瘤組織中VEGF的表達(dá)與MVD呈正相關(guān)（r＝0.475，P＜0.05）；EMMPRIN 與 VEGF及Ki－67的表達(dá)呈正相關(guān)（r＝0.702、0.534，P＜0.05）。

3 討 論

3.1 人胰腺癌荷瘤裸鼠束縛應(yīng)激模型的建立

本實(shí)驗(yàn)在應(yīng)激過(guò)程中不壓擠動(dòng)物，動(dòng)物可以前后活動(dòng)并不感到疼痛，僅僅是心理感到限制束縛，因此在很大程度上動(dòng)物處于心理應(yīng)激，從而基本控制了生理應(yīng)激對(duì)裸鼠影響。雖然心理應(yīng)激反應(yīng)因應(yīng)激原種類(lèi)、動(dòng)物種屬、性別、生理狀態(tài)、應(yīng)激狀態(tài)的不同而有所差異，但血清兒茶酚胺和糖皮質(zhì)激素含量升高被視為應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)志。本文結(jié)果顯示，荷瘤＋應(yīng)激組血清腎上腺素含量明顯高于單純荷瘤組，說(shuō)明人胰腺癌荷瘤裸鼠不良心理應(yīng)激模型建立成功。

3.2 應(yīng)激與腫瘤細(xì)胞增殖的關(guān)系

Ki－67是一種細(xì)胞核增殖相關(guān)抗原，可反映腫瘤的增殖速度。近來(lái)的研究顯示，Ki－67在人類(lèi)乳癌、血液腫瘤等多種惡性腫瘤中均過(guò)度表達(dá)［5］。本實(shí)驗(yàn)荷瘤＋應(yīng)激組移植瘤組織中Ki－67的陽(yáng)性表達(dá)顯著高于單純荷瘤組，說(shuō)明束縛應(yīng)激增強(qiáng)了胰腺癌細(xì)胞的增殖活性，促進(jìn)了腫瘤的生長(zhǎng)。原因可能是束縛應(yīng)激時(shí)機(jī)體內(nèi)分泌激素水平發(fā)生變化，交感神經(jīng)和腎上腺釋放的兒茶酚胺類(lèi)物質(zhì)于腫瘤微環(huán)境中，可刺激腫瘤細(xì)胞的增殖，可能同時(shí)也會(huì)提高腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力和促血管生成能力。

3.3 應(yīng)激與腫瘤微血管生成的關(guān)系

VEGF又稱(chēng)血管通透因子（VPF），與細(xì)胞上的相應(yīng)受體VEGFR結(jié)合而發(fā)揮作用［6］，具有誘導(dǎo)血管生成及抑制細(xì)胞凋亡等多種功能 。CD105可以選擇性地表達(dá)在處于增殖狀態(tài)的血管，比常規(guī)標(biāo)記血管的指標(biāo)如CD34更能說(shuō)明血管生成的情況。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，荷瘤＋應(yīng)激組移植瘤組織中VEGF的陽(yáng)性表達(dá)和MVD顯著高于單純荷瘤組，而且移植瘤組織中VEGF的表達(dá)與MVD呈明顯的正相關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示應(yīng)激可能通過(guò)上調(diào)移植瘤組織中VEGF的表達(dá)，而促進(jìn)腫瘤微血管的生成。一方面隨著腫瘤迅速生長(zhǎng)，腫瘤組織內(nèi)部低氧，由于荷瘤＋應(yīng)激組裸鼠移植瘤生長(zhǎng)較單純荷瘤組迅速且瘤體積較大，所以移植瘤組織內(nèi)部低氧更嚴(yán)重一些，低氧誘導(dǎo)因子－1誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞VEGF的表達(dá)［7］。另一方面，由于荷瘤＋應(yīng)激裸鼠體內(nèi)兒茶酚胺類(lèi)物質(zhì)水平升高，其中腎上腺素可以與其受體相結(jié)合，從而激活c A MP－蛋白激酶A信號(hào)傳導(dǎo)通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞VEGF的表達(dá)。

3.4 應(yīng)激與腫瘤組織中EMMPRIN的關(guān)系

EMMPRIN可作用于鄰近的腫瘤細(xì)胞以及間質(zhì)中的成纖維細(xì)胞，分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），降解基底膜，水解腫瘤細(xì)胞表面的黏附成分，降低細(xì)胞間的黏附性，而有助于癌細(xì)胞的遷移［8］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，荷瘤＋應(yīng)激組移植瘤組織中EMMPRIN的陽(yáng)性表達(dá)顯著高于單純荷瘤組，提示應(yīng)激能刺激腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生分泌EMMPRIN蛋白，導(dǎo)致其活性升高，并導(dǎo)致可溶性的EMMPRIN蛋白的釋放，進(jìn)而又可通過(guò)旁分泌途徑促進(jìn)鄰近的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生MMPs和EMMPRIN，形成正反饋的調(diào)節(jié)機(jī)制，促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。

3.5 移植瘤組織中EMMPRIN和Ki－67、VEGF表達(dá)的相關(guān)性

本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，裸鼠胰腺癌移植瘤組織中EMMPRIN與Ki－67、VEGF的表達(dá)均呈正相關(guān)，提示EMMPRIN高表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和血管的生成。EMMPRIN提高腫瘤細(xì)胞增殖能力的確切機(jī)制目前仍不是很清楚。其可能機(jī)制如下：①EMMPRIN誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致潛伏在細(xì)胞外空間的生長(zhǎng)因子釋放，從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)［9－10］；②EMMPRIN 通過(guò)增加透明質(zhì)烷的水平來(lái)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞錨著非依賴(lài)性生長(zhǎng)［11］；③EMMPRIN還可以通過(guò)減少促進(jìn)凋亡蛋白的聚集來(lái)保護(hù)細(xì)胞免于失巢凋亡［12］。

總之，本文研究結(jié)果提示，應(yīng)激狀態(tài)促進(jìn)裸鼠胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)機(jī)制可能是通過(guò)激活神經(jīng)內(nèi)分泌信號(hào)傳導(dǎo)通路，上調(diào)EMMPRIN和VEGF的表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖和血管生成而實(shí)現(xiàn)的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為胰腺癌的治療提供了新的思路。

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