細菌中LuxS/AI-2密度感應(yīng)系統(tǒng)分子機制研究進展

楊瑞寧， 操 敏， 李先富， 牛 雷

(1.解放軍81醫(yī)院檢驗科，江蘇 南京210002;2.南京軍區(qū)疾病預防控制中心，江蘇南京210002)

近年來的研究證明，細菌之間存在信息交流，許多細菌都能合成并釋放一種稱為自誘導物質(zhì)(autoinducer，AI)的信號分子。胞外的AI濃度能隨細菌密度的增加而增加。當達到臨界濃度時，AI能結(jié)合并激活細胞內(nèi)受體，啟動菌體中相關(guān)基因的表達，從而調(diào)控細菌的生理行為，產(chǎn)生毒力因子等，使細胞的活動具有組織性，成為類似于多細胞生物的群體性活動。由于這一現(xiàn)象是細菌密度依賴的方式，因此稱為密度感應(yīng)(quorum sensing，QS)。

目前，已發(fā)現(xiàn)多種QS系統(tǒng)，他們或分別或共同作用，調(diào)控細菌的代謝、生理、毒力等多種功能。我們介紹的是在革蘭陽性和陰性細菌中共同的LuxS/AI-2 QS信號系統(tǒng):信號分子為呋喃酰硼酸二酯(furanosylborate diester)一類分子，能被不同種屬細菌識別，即AI-2信號分子，其合成主要依賴于在許多菌屬序列保守的 luxS基因編碼的LuxS蛋白酶。目前已報道在超過80種細菌中廣泛存在［1-2］。我們從該系統(tǒng)信號分子的AI-2發(fā)現(xiàn)、合成、LuxS蛋白結(jié)構(gòu)及其與信號分子相互作用的機制等方面綜述了該系統(tǒng)分子機制的研究進展，為尋找新型抗菌藥物提供新靶點，也為控制感染提供新思路。

一、LuxS/AI-2 QS分子機制

(一)AI-2信號分子的發(fā)現(xiàn)

早在1993年，Bassler等［3］首次發(fā)現(xiàn)哈氏弧菌在產(chǎn)生并感應(yīng)AI-1信號分子的同時，還能產(chǎn)生并感應(yīng)AI-2信號分子。他們巧妙地從哈氏弧菌野生株BB120中將感應(yīng)AI-1的感應(yīng)子失活突變，獲得哈氏弧菌突變株BB170(sensor1-，sensor2+)，僅能感應(yīng)AI-2引起的發(fā)光反應(yīng)。因此，在AI-2介導QS成分未鑒定之前，用該報告菌株已檢測到該誘導分子的存在［4］。1997年，他們發(fā)現(xiàn)不同種屬的細菌如霍亂弧菌和副溶血性弧菌等都能引起哈氏弧菌的發(fā)光反應(yīng)，表明AI-2活性是非特異性的［5］。1999年，仍是這個研究小組，利用基因文庫、轉(zhuǎn)座子圖標等技術(shù)，從哈氏弧菌野生株BB120、沙門氏菌、大腸埃希菌中篩選到能產(chǎn)生AI-2信號的轉(zhuǎn)化子，鑒定到合成AI-2的LuxS蛋白酶基因序列，并發(fā)現(xiàn)該基因堿基序列在許多細菌中高度保守［6］。

(二)AI-2的合成途徑

雖然1999年Surette等鑒定了LuxS蛋白能產(chǎn)生AI-2，2002年Winzer等［7］在看40年前文獻時無意中發(fā)現(xiàn)，早在上世紀60年代，就有關(guān)于LuxS蛋白作為活化甲基循環(huán)(activated methyl cycle，AMC)途徑中代謝酶的描述，并闡述了AI-2前體4，5-二羥基2，3-戊二酮(4，5-dihydroxy 2，3-pentailedion，DPD)的形成機制。AI-2的合成由S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)通過三步酶催化反應(yīng)生成。SAM作為甲基供體產(chǎn)生有毒的中間產(chǎn)物 S-腺苷高半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine，SAH)，隨即被 S-腺苷高半胱氨酸核苷酸酶水解為S-核糖高半胱氨酸(S-ribosylhomocysteine，SRH)和腺嘌呤，LuxS 蛋白作為SRH裂解酶，催化SRH產(chǎn)生高半胱氨酸。高半胱氨酸經(jīng)過至少三步反應(yīng)再生成SAH，進入下一輪循環(huán)。DPD經(jīng)過自發(fā)環(huán)化形成AI-2。AI-2其實是一類信號分子的總稱，他們均由共同的前體DPD轉(zhuǎn)變而來。在大多數(shù)已知產(chǎn)生AI-2的細菌中，合成AI-2的途徑都是相同的，由LuxS蛋白催化產(chǎn)生。然而，基于一些沒有LuxS蛋白同源物的高等有機體能產(chǎn)生AI-2類似活性，并且體外實驗證實，D-5-磷酸核酮糖(ribulose-5-phosphate，Rul-5-P)能自發(fā)去磷酸形成DPD，DPD自發(fā)環(huán)化形成能產(chǎn)生AI-2發(fā)光活性的4-羥-5甲基呋喃［4-hydroxy-5-methyl-3(2H)-furanone，MHF］［8］。2008年有學者發(fā)現(xiàn)，大腸埃希菌pgi-eda-edd luxS突變菌株以Rul-5-P為專一中間產(chǎn)物，完全通過氧化戊糖途徑降解葡萄糖。但在其富含葡萄糖培養(yǎng)上清液中，可檢測到微弱的AI-2樣活性。提示Rul-5-P很可能在體內(nèi)提供一種不依賴LuxS蛋白形成AI-2的新路線［9］。但他們也指出，這種不依賴LuxS蛋白形成AI-2的途徑在大腸埃希菌中是可以忽略的，可能在缺乏LuxS蛋白的菌株中起作用［10］。由Rul-5-P自動轉(zhuǎn)化產(chǎn)生足以檢測到AI-2活性的DPD水平具有重要意義。Rul-5-P在代謝活躍的細胞中無所不在，很可能AI-2類似分子是所有有機體戊糖磷酸代謝的內(nèi)在產(chǎn)物，不依賴LuxS蛋白酶催化。有報道在化膿性鏈球菌、豬鏈球菌2型、變形鏈球菌的luxS突變株培養(yǎng)上清液中都檢測到微弱AI-2信號［11-12］。此外，這也可以解釋在不含LuxS蛋白同源物的細菌中，如草木樨中華根瘤菌中也存在Lsr-型的AI-2攝取和AI-2激酶系統(tǒng)［13］，可能是為了盡可能地減少內(nèi)源生成DPD產(chǎn)物的損失或是掠奪微環(huán)境中其他細菌、植物釋放的AI-2類分子。

(三)AI-2分子結(jié)構(gòu)

AI-2的分子結(jié)構(gòu)最早是 Chen等［14］在2002年研究哈氏弧菌的AI-2受體蛋白LuxP結(jié)晶結(jié)構(gòu)時，偶然發(fā)現(xiàn)與其結(jié)合共結(jié)晶的AI-2分子，通過X-射線結(jié)晶學分析揭示其結(jié)構(gòu)為呋喃酰硼酸二酯。2004年，Miller在對大腸埃希菌和沙門氏菌研究中，以相同的方法確定了與胞質(zhì)結(jié)合蛋白LsrB(LuxS調(diào)節(jié)B蛋白)結(jié)合的AI-2結(jié)構(gòu)為呋喃酰二酯(R-THMF)，而并不是硼酸呋喃酯［15］。這種區(qū)別可能是因為硼在海洋環(huán)境很豐富，而大腸埃希菌和沙門氏菌生存的小腸環(huán)境則很少的緣故。R-THMF與D-核糖的相似性很高。另一種已揭示的體外合成AI-2的分子結(jié)構(gòu)為MHF，但他是否作為體內(nèi)的AI-2分子起作用仍需要更多的證據(jù)。除此之外，雖然在超過70種細菌中報告有AI-2活性，但由于缺乏相關(guān)AI-2結(jié)合蛋白的信息，大多數(shù)細菌中AI-2具體結(jié)構(gòu)尚不清楚。不同種屬的AI-2分子可能存在一定差異，但都具有很高的相似性，可以被不同菌屬相互識別，從而成為不同種屬間交流的語言。

(四)LuxS蛋白結(jié)構(gòu)

LuxS蛋白是一種小分子金屬酶，催化SAM循環(huán)中一個穩(wěn)定的硫醚鍵的非氧化還原裂解以產(chǎn)生AI-2。自然界能催化這種反應(yīng)的酶很少，一般都需要具有氧化還原活性的輔助因子，但LuxS蛋白可以獨立完成這個反應(yīng)。至少有5種細菌(幽門螺旋桿菌、嗜血流感菌、耐輻射球菌、精細芽孢桿菌和變形鏈球菌)中的LuxS蛋白獲得了晶體結(jié)構(gòu)并進行了X射線衍射圖形分析［16-21］。該活性蛋白以同源二聚體的形式存在，來自于2個亞基的氨基酸殘基在二聚體界面上形成2個相同的活性位點，每個活性位點含有1個二價金屬離子，起初認為是Zn2+，后來證實是Fe2+。對比多個菌屬的LuxS同源氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)LuxS蛋白序列中存在一個保守、穩(wěn)定的模體(His-Xaa-Xaa-Glu-His，HXXGH)。該模體的2個組氨酸支鏈與金屬離子配位，第4個配位點的半胱氨酸與水分子結(jié)合［17］。通過對哈氏弧菌LuxS氨基酸序列的深入研究發(fā)現(xiàn)，另一個革蘭陰性菌特征性模體為Lys-Ile-Pro-Glu-Leu-Asn-Glu-Tyr，該序列與酪氨酸激酶磷酸化位點［Lys/Arg］-Xaa2-3-［Asp/Glu］-Xaa2-3-Tyr完全匹配，在已知的幾種革蘭陰性菌中該位點的結(jié)構(gòu)非常保守［22］。在大腸埃希菌中Cys-84和Glu-57被證實在催化活性中起重要作用，還有S9、H11和Arg39對LuxS蛋白完整活性很重要。通過點突變分析，活性位點上第83位保守的半胱氨酸殘基為LuxS蛋白催化活性所必需，且為該蛋白翻譯后修飾位點［23-24］。在空腸彎曲菌中發(fā)現(xiàn)LuxS蛋白上決定AI-2分子活性的關(guān)鍵氨基酸G92D一個突變可導致細菌喪失產(chǎn)生AI-2分子的能力［25］。大多數(shù)LuxS蛋白在骨架結(jié)構(gòu)中具有很高的相似性，但是Moitrayee Bhattacharyya等應(yīng)用蛋白結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)(protein structure networks，PSN)及圖像理論分析手段，對23種細菌的LuxS蛋白晶體結(jié)構(gòu)或模式結(jié)構(gòu)的二聚體界面模體進行分析，發(fā)現(xiàn)不同類別LuxS蛋白結(jié)構(gòu)界面模體在其支鏈相互作用水平上是有特征性差異的，并指出不同特征的界面與其生物功能如致病性之間存在一定關(guān)聯(lián)。同時，他們還用該方法揭示了界面上潛在的突變位點和幾何模式［26］。對于LuxS蛋白的結(jié)構(gòu)分析可以使我們更好地理解LuxS蛋白在細菌中的作用，還可以為設(shè)計LuxS蛋白酶的抑制分子指明方向，探索研制新型抗菌劑。

(五)AI-2作用機制及影響因素

目前能與AI-2結(jié)合并確定作用機制的受體蛋白僅2種，分別是哈氏弧菌中的LuxP蛋白和大腸埃希菌及沙門氏菌中的LsrB蛋白，其作用機制有所不同。有報道RbsB(核糖結(jié)合蛋白)也能與AI-2結(jié)合，其作用機制尚不明確。

圖1 哈氏弧菌多重QS系統(tǒng)的作用通路

1.通過受體LuxQP途徑的AI-2感應(yīng)調(diào)控機制 該途徑目前僅在弧菌屬發(fā)現(xiàn)，對于AI-2在哈氏弧菌中的調(diào)控機制了解得比較清楚［27］。LuxP是直接與AI-2結(jié)合的可溶性周質(zhì)結(jié)合蛋白;LuxQ是一種雙組分蛋白，與AH1-1受體LuxN類似，由感應(yīng)激酶和反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白2種成分組成，可識別AI-2/LuxP復合物。以AI-2感應(yīng)發(fā)光為例闡述其作用機制:當環(huán)境中細菌密度低時(即無信號分子存在時)，LuxQ通過自磷酸化將磷酸轉(zhuǎn)移給磷酸轉(zhuǎn)移酶蛋白LuxU，接著傳遞給反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白LuxO。磷酸化的LuxO在活性狀態(tài)下，與σ54一起激活小RNA，小RNA與其RNA伴侶Hfq一起，使編碼激活蛋白LuxR的mRNA處于不穩(wěn)定狀態(tài)。由于LuxR是熒光素酶操縱子LuxCDABE轉(zhuǎn)錄所必須的，在此狀態(tài)下細菌不發(fā)光。由于信號分子的作用，LuxQ從激酶狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿崦?，磷酸的流向正好相反，去磷酸化的LuxQ是不活躍的，不能增強小RNA的表達，使得處于抑制狀態(tài)的LuxR得以轉(zhuǎn)錄，LuxR結(jié)合LuxR啟動子，激活熒光素酶的表達致使菌體發(fā)光。在哈氏弧菌中，有3個平行的QS系統(tǒng)，除AI-2/LuxS系統(tǒng)外，還有?；呓z氨酸環(huán)內(nèi)酯類AHI-1為信號分子的LuxM/LuxN QS系統(tǒng)，以及最先在霍亂弧菌中發(fā)現(xiàn)的霍亂自誘導分子1(cholerae autoinducer1，CAI-1)信號分子QS系統(tǒng)。在哈氏弧菌中這3個QS系統(tǒng)各自都能獨立完成調(diào)控功能，但任何一個系統(tǒng)都可以對調(diào)控起增效作用，并且3個系統(tǒng)共享從LuxU開始的信號級聯(lián)傳遞通路，見圖1。實際上，在哈氏弧菌中3個QS系統(tǒng)都是通過該通路來調(diào)控靶基因的表達，包括調(diào)控生物發(fā)光、三型分泌系統(tǒng)、鐵載體、多糖、非金屬蛋白酶生成等多種生物功能［28］。在霍亂弧菌中有 2種 QS系統(tǒng)［29］，即AI-2信號分子的LuxS/LuxP和CAI-1類的CqsSQS，也是通過與哈氏弧菌類似的QS信號傳遞通路調(diào)控靶基因，但目前這樣的通路僅在弧菌屬部分細菌中被發(fā)現(xiàn)。Sun等［1］對138種細菌微生物的全基因組序列進行檢測發(fā)現(xiàn)，盡管LuxS廣泛存在于不同細菌，其中僅28種細菌含有與LuxP結(jié)構(gòu)類似的蛋白，104種細菌含有與LuxQ和LuxO類似的蛋白結(jié)構(gòu)，但還沒有足夠的證據(jù)說明這些細菌微生物中亦存在與哈氏弧菌同樣的AI-2感應(yīng)識別路徑，他們可能通過其他完全不同的感應(yīng)通路識別AI-2，或者根本不存在QS系統(tǒng)。

2.通過ABC-轉(zhuǎn)運子LsrB途徑的AI-2作用機制 直接與AI-2結(jié)合的蛋白LsrB是通過眾多尋找AI-2相關(guān)基因的研究發(fā)現(xiàn)的，主要在大腸埃希菌和沙門氏菌中存在［30-31］，在引起牙周炎疾病的伴放線桿菌中也有報道［32］。在大腸埃希菌和沙門氏菌中，整個對數(shù)生長期都能檢測到AI-2存在，但進入靜止期后AI-2急劇減少，這個現(xiàn)象引起了研究者的興趣。2001年Taga等［33］通過隨機插入突變技術(shù)，鑒定了在沙門氏菌14028及其突變株中差異表達的7個基因位于同一操縱子IsrACDBFGE，能被胞外添加的AI-2激活。類似的操縱子于2005年在大腸埃希菌中也得到鑒定。Lsr操縱子前4個基因編碼ABC型轉(zhuǎn)運子，LsrB與核糖轉(zhuǎn)運子Rbs高度同源，AI-2通過轉(zhuǎn)運子進入細胞時磷酸化，然后與阻遏蛋白LsrR結(jié)合，誘導IsrACDBFGE的轉(zhuǎn)錄。細菌分泌到胞外的AI-2被運回細胞內(nèi)的機制，從代謝角度可以認為通過Lsr(LuxS調(diào)節(jié)蛋白)轉(zhuǎn)運AI-2可能是在優(yōu)勢碳源不足的情況下，AI-2作為戊糖參與到糖代謝途徑;從QS的角度理解可以認為細菌為了避免周圍環(huán)境中其他細菌掠奪他的信號資源而采取的措施。事實上，AI-2在大腸埃希菌和沙門氏菌中是否真的作為QS信號分子是一直有爭議的。因為AI-2調(diào)節(jié)的靶基因IsrACDBFGE目前確認的功能就是攝取、磷酸化和降解AI-2，Lsr的轉(zhuǎn)錄可被代謝中間產(chǎn)物絲狀噬菌體(M13K07)G3蛋白N端結(jié)構(gòu)域(PⅢN1)基因和磷酸二羥丙酮抑制的事實也支持其代謝作用的說法。在伴放線桿菌中，已證實LsrB與AI-2結(jié)合并與QS功能密切相關(guān)，但尚未有直接調(diào)控靶基因的證據(jù)。很可能在弧菌外，用AI-2作為QS信號的細菌遠沒有想象中多，需要進一步尋找AI-2調(diào)控機制的證據(jù)來闡述在其他細菌中的QS現(xiàn)象。

3.可能通過RbsB蛋白的AI-2調(diào)控機制在伴放線菌屬和非典型流感嗜血菌中都觀察到RbsB蛋白在對AI-2應(yīng)答中的重要作用。RbsB是核糖結(jié)合蛋白，也是一種 ABC型轉(zhuǎn)運子，與LsrB蛋白存在一定相似性。在伴放線桿菌中，已證實RbsB和LsrB共同作為AI-2的結(jié)合蛋白，并以QseBC雙組分蛋白作為AI-2調(diào)控單元的級聯(lián)效應(yīng)過程的組分，調(diào)控細菌的生物膜形成及毒力功能［32］。在非典型流感嗜血菌86-028NP株中，已證實RbsB是 AI-2結(jié)合蛋白，rbsB突變株與luxS突變株相似，生物膜變薄且總量及磷酸膽堿減少，細菌在栗鼠耳中存留能力降低，表明其是LuxS/AI-2調(diào)節(jié)蛋白，為攝入和應(yīng)答AI-2所必需［34］。但目前還沒有其直接調(diào)控靶基因的證據(jù)，該途徑作用的通路還需進一步明確。關(guān)于AI-2調(diào)節(jié)作用的最新報道是對于幽門螺旋桿菌的研究，細菌通過化學感應(yīng)受體TlpB將AI-2作為化學排斥劑來感應(yīng)，這一作用與細菌的泳動功能相關(guān)［35］;在沙門氏菌中，脂肪酸分子能調(diào)節(jié)AI-2對細菌侵襲力的影響［36］，其具體作用機制尚不清楚。

二、針對LuxS/AI-2系統(tǒng)制定新型抗菌策略

隨著LuxS/AI-2系統(tǒng)分子機制的揭示，提示了一種新型抗菌策略，即設(shè)計干擾致病菌LuxS/AI-2系統(tǒng)的新藥物，以達到控制病菌的目的。目前已嘗試的方法如下。

1.抑制LuxS蛋白酶活性 Malladi等［37］設(shè)計LuxS蛋白酶作用底物SRH的類似物，與SRH競爭結(jié)合LuxS蛋白酶活性位點，達到抑制AI-2分子產(chǎn)生的目的。

2.抑制AI-2分子信號功能 設(shè)計AI-2分子類似物，與受體蛋白競爭性結(jié)合來阻斷AI-2介導的信號通路。L?nn-Stensrud 等［38］合成了(Z)-5-溴化亞甲基2(5H)-呋喃分子，發(fā)現(xiàn)該分子抑制了咽峽炎鏈球菌、中間鏈球菌和變形鏈球菌的生物膜形成及誘導哈氏弧菌 BB152發(fā)光能力，但對咽峽炎鏈球菌與中間鏈球菌luxS突變株形成生物膜能力無影響，顯示出其干擾AI-2信號通路的作用。Ren等［39］發(fā)現(xiàn)由海洋紅藻產(chǎn)生的天然(5Z)-4-溴-5-(溴化亞甲基)-3-丁基-2(5H)-呋喃作為AI-2抑制劑，通過干擾AI-2介導的QS抑制大腸埃希菌中生物膜的形成及成群現(xiàn)象，并且基因芯片分析結(jié)果顯示，該溴化呋喃與AI-2作用于相似的一套基因，但對于基因表達所起的效應(yīng)不同，從而改變了AI-2信號作用［40］。此外，還可以尋找降解AI-2分子的酶來干擾此QS系統(tǒng)。可以預見，對于致病菌的防控方面，QS系統(tǒng)是具有研究和應(yīng)用前景的新藥靶標。

三、結(jié)束語

LuxS/AI-2廣泛分布于多種細菌中，目前除弧菌、大腸埃希菌、沙門氏菌外，大多數(shù)細菌中AI-2在體內(nèi)的調(diào)控途徑以及與相鄰細菌交流的機制尚不清楚，詮釋LuxS/AI-2在QS和代謝中的相關(guān)功能，可為尋找新型抗菌藥物提供新靶點，為控制感染提供新思路，將具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。

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