hPEDF基因修飾對(duì)巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)RPE細(xì)胞增殖的影響

劉 姝 王霽雪 王瑩雪 吳雅臻 李亞萍 (吉林大學(xué)第二醫(yī)院眼科，吉林 長春 130041)

巨噬細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞是增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變(PVR)中的重要細(xì)胞組成成分。巨噬細(xì)胞廣泛存在于視網(wǎng)膜增殖膜中，在炎癥早期和傷口愈合過程中起重要的調(diào)控作用，能通過炎癥及免疫反應(yīng)啟動(dòng)和促進(jìn)眼內(nèi)細(xì)胞增殖。而RPE細(xì)胞是視網(wǎng)膜前細(xì)胞性膜形成中的主要效應(yīng)細(xì)胞，其增殖常能導(dǎo)致牽拉性視網(wǎng)膜脫離，引發(fā)PVR形成。研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞可促進(jìn)RPE細(xì)胞增殖、移行〔1〕。本實(shí)驗(yàn)觀察巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)RPE細(xì)胞及重組人色素上皮衍生因子(hPEDF)基因修飾的RPE細(xì)胞的增殖作用，對(duì)PEDF在PVR中的作用進(jìn)行初步的體外研究。

1 材料與方法

1.1 材料 本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建成功的含有hPEDF基因的真核表達(dá)載體pcDNA3-PEDF〔2〕。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、G418為GIBCO公司產(chǎn)品。脂質(zhì)體(Lipofectamine 2000)為Invitrogen公司產(chǎn)品。人RPE細(xì)胞株(D407)來自廣州中山細(xì)胞庫。抗hPEDF單克隆抗體為R＆D公司產(chǎn)品。通用型RT-PCR試劑盒為鼎國生物技術(shù)公司產(chǎn)品。淋巴細(xì)胞分離液為北京化學(xué)試劑公司產(chǎn)品;二甲基亞砜(DMSO)為Sigma公司產(chǎn)品;噻唑藍(lán)(MTT)為Sigma公司產(chǎn)品，用磷酸鹽緩沖液(PBS)配成5 g/L的溶液，過濾除菌備用。

1.2 方法

1.2.1 RPE細(xì)胞的培養(yǎng)和傳代 細(xì)胞凍存和復(fù)蘇:細(xì)胞約106，消化離心后棄上清液，加入凍存液(50%培養(yǎng)基+40%胎牛血清+10%DMSO)1 ml，放置于4℃ 2～3 h后改置于－80℃24 h，然后放入液氮中保存。復(fù)蘇時(shí)，將細(xì)胞自液氮中取出，37℃水浴迅速搖動(dòng)溶解，培養(yǎng)瓶中預(yù)先加入37℃的培養(yǎng)液，將細(xì)胞懸液逐滴加入培養(yǎng)瓶中，搖勻充分混合，靜置5%CO2的37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)人RPE細(xì)胞株，2～3 d傳代1次，于37℃ 5%CO2及飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)和傳代。

1.2.2 RPE細(xì)胞的G418最小致死劑量測(cè)定 24孔板接種適量的RPE細(xì)胞。細(xì)胞長至板底面積50% ～60% 時(shí)，加入含有不同濃度 G418(濃度分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1 g/L)培養(yǎng)液。2～3 d換液1 次，10 d左右根據(jù)細(xì)胞死亡情況確定G418對(duì)于RPE細(xì)胞的最小致死劑量。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和篩選 (1)細(xì)胞準(zhǔn)備:選取復(fù)蘇后第2代的RPE細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。取旺盛生長期的RPE細(xì)胞以2×105個(gè)細(xì)胞/孔，接種六孔培養(yǎng)板，37℃ 5%CO2飽和濕度培養(yǎng)24 h，待其細(xì)胞密度(面積百分比)達(dá)到90%。(2)細(xì)胞轉(zhuǎn)染:無血清、無抗生素的細(xì)胞培養(yǎng)基加入轉(zhuǎn)染前的細(xì)胞，洗2次;A、B混合液(A液:10 μg PEDF質(zhì)粒DNA+50 μl無血清培養(yǎng)液;B液:2 μl Lipofectamine 2000+50 μl無血清培養(yǎng)液;合并 A、B 液，置于室溫15 min)中加入0.8 ml無血清培養(yǎng)液，混勻后加入培養(yǎng)的細(xì)胞，在5%CO2的37℃培養(yǎng)箱放置6 h后棄轉(zhuǎn)染液，加入10%胎牛血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。(3)穩(wěn)定表達(dá)PEDF基因的細(xì)胞克隆篩選:72 h后傳代，對(duì)照組和轉(zhuǎn)染PEDF的細(xì)胞以1∶10傳代，接種在60 mm的培養(yǎng)皿，加入含G418的選擇培養(yǎng)基，14 d后有明顯克隆形成，用胰酶消化法轉(zhuǎn)移細(xì)胞克隆，分別擴(kuò)增培養(yǎng)。

1.2.4 轉(zhuǎn)染細(xì)胞PEDF的鑒定 選取RPE細(xì)胞(復(fù)蘇后第2代)和轉(zhuǎn)染后的RPE細(xì)胞，采用RT-PCR(引物:5'-ATG TCG GAC CCT AAG GCT GT-3';5'-CCC ATC CTC GTT CCA CTC AA-3')及免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)有無PEDF表達(dá)。

1.2.5 巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基的制備 收集肝硬化腹水患者腹腔穿刺液2 L，離心后傾去上清后加入6 ml D-Hank液混勻，然后加于3 ml淋巴細(xì)胞分離液之上，2 000 r/min密度梯度離心?；厥盏?層白色膜狀層，D-Hank液洗滌3次，加入10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，制成細(xì)胞懸液，置于75 ml培養(yǎng)瓶中，37℃ 5%CO2孵箱內(nèi)孵育30 min，去除未貼壁細(xì)胞，加入含0.1%利多卡因的DMEM培養(yǎng)液孵育30 min，解除巨噬細(xì)胞貼壁，1 000 r/min離心5 min，DMEM洗滌2次，獲得高純度的巨噬細(xì)胞。經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后以1×106/ml接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，加DMEM(不含血清)至 1 000 μl，37℃ 5%CO2孵箱內(nèi)孵育培養(yǎng)24 h，取上清，1 000 r/min離心5 min，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 MTT比色法 取培養(yǎng)的RPE細(xì)胞及重組hPEDF基因修飾的RPE細(xì)胞，以5×103個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板內(nèi)，37℃5%CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h，細(xì)胞近融合時(shí)，吸出孔內(nèi)液體，加入等量不含血清的DMEM 24 h，細(xì)胞生長同步化后，進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。設(shè)立正常對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組分別加入巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基，濃度分別為12.5%、25.0%、50.0%的體積分?jǐn)?shù)。液體總量200 μl/孔，分別培養(yǎng)24、48、72 h，作用時(shí)間完成后，每孔加入MTT溶液20 μl，37℃ 5%CO2繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)。吸出孔內(nèi)全部液體，每孔加入150 μl DMSO，室溫下?lián)u晃震蕩30 min，使結(jié)晶完全溶解，于酶標(biāo)儀上570 nm波長處以空白孔調(diào)零，測(cè)各孔OD值。每一濃度設(shè)8個(gè)平行孔。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以s表示，采用方差分析、q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 RPE細(xì)胞對(duì)G418的耐受試驗(yàn) 加入G418后第4天，高濃度(0.7～1.1 g/L)孔內(nèi)出現(xiàn)細(xì)胞死亡脫落現(xiàn)象;第12天，0.3 g/L濃度孔內(nèi)可見少數(shù)細(xì)胞存活生長，0.4 g/L及以上濃度孔內(nèi)均無細(xì)胞生長。因此，0.4 g/L G418可作為RPE細(xì)胞neo基因的篩選濃度。

2.2 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選 轉(zhuǎn)染后的RPE細(xì)胞加入含0.4 g/L G418的選擇培養(yǎng)基，14 d后有明顯克隆形成，用胰酶消化法轉(zhuǎn)移細(xì)胞克隆擴(kuò)增培養(yǎng)。

2.3 轉(zhuǎn)染前后RPE細(xì)胞形態(tài)觀察 穩(wěn)定表達(dá)PEDF的RPE細(xì)胞株表現(xiàn)出類似原代RPE細(xì)胞的形態(tài)，細(xì)胞排列致密，大量色素分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，圍繞細(xì)胞核。而未轉(zhuǎn)染的PRE細(xì)胞呈均一透明的梭形。見圖1。

2.4 轉(zhuǎn)染細(xì)胞PEDF表達(dá)的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 提取的RPE細(xì)胞總RNA，OD260/OD280為1.8～2.0，說明提取的RNA純度較高;1.5%瓊脂糖凝膠電泳可見清晰的28 S和18 S亞基泳帶(圖2)，表明所提取的RNA完整，可用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。在沒有轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，未檢測(cè)到PEDF mRNA特異性的表達(dá)條帶，pcDNA3-PEDF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的RPE細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到PEDF mRNA的表達(dá)，RT-PCR產(chǎn)物凝膠電泳，可見PEDF mRNA特異條帶出現(xiàn)。見圖3。

2.5 免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果 pcDNA3-PEDF轉(zhuǎn)染的RPE細(xì)胞經(jīng)G418篩選后，在蓋玻片上培養(yǎng)24 h，采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定表達(dá)PEDF的轉(zhuǎn)染RPE細(xì)胞，結(jié)果顯示RPE細(xì)胞內(nèi)有PEDF陽性表達(dá)。見圖4。

2.6 MTT分析結(jié)果 巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基可誘導(dǎo)RPE細(xì)胞增殖，作用24、48、72 h后，各個(gè)濃度的實(shí)驗(yàn)組OD值較之相應(yīng)時(shí)間的對(duì)照組均不同程度增加(P＜0.01);巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基亦對(duì)重組hPEDF基因修飾的RPE細(xì)胞的增殖有誘導(dǎo)作用，除巨噬細(xì)胞(12.5%)24 h組外，其余各個(gè)濃度的實(shí)驗(yàn)組較之相應(yīng)時(shí)間的對(duì)照組均不同程度地引起OD值增加(P＜0.01或P＜0.05)。重組hPEDF基因修飾的RPE細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染的RPE細(xì)胞在無巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的情況下，僅于培養(yǎng)72 h兩組間OD值差異有顯著性(P＜0.05)。應(yīng)用不同濃度的巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)重組hPEDF基因修飾的RPE細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染的RPE細(xì)胞相應(yīng)時(shí)間的實(shí)驗(yàn)組之間比較，OD值有顯著性差異(P ＜0.01)。見表1，表2。

圖4 免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果(×200)

表1 不同濃度巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基下RPE細(xì)胞的OD值變化(s)

表1 不同濃度巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基下RPE細(xì)胞的OD值變化(s)

與正常對(duì)照組比較:1)P＜0.01

0.208±0.020 0.217±0.013 0.229±0.013巨噬細(xì)胞(12.5%)0.251±0.0181)0.270±0.0241)0.296±0.0181)巨噬細(xì)胞(25.0%)0.276±0.0271)0.307±0.0311)0.321±0.0211)巨噬細(xì)胞(50.0%)0.273±0.0101)0.303±0.0201)0.323±0.0221)24 h 48 h 72 h正常對(duì)照組組別

表2 不同濃度巨噬細(xì)胞條件下培養(yǎng)基下重組hPEDF基因修飾的RPE細(xì)胞的OD值變化(s)

表2 不同濃度巨噬細(xì)胞條件下培養(yǎng)基下重組hPEDF基因修飾的RPE細(xì)胞的OD值變化(s)

與正常對(duì)照組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

0.203±0.011 0.209±0.032 0.216±0.018巨噬細(xì)胞(12.5%)0.220±0.041 0.235±0.0221)0.251±0.0172)巨噬細(xì)胞(25.0%)0.249±0.0222)0.264±0.0252)0.289±0.0332)巨噬細(xì)胞(50.0%)0.251±0.0112)0.269±0.0372)0.290±0.0202)24 h 48 h 72 h正常對(duì)照組組別

3 討論

巨噬細(xì)胞是PVR形成過程中的細(xì)胞因素之一，主要來源于血液、RPE細(xì)胞及玻璃體細(xì)胞等，在PVR的發(fā)病中有著重要作用。首先巨噬細(xì)胞是普通炎癥反應(yīng)中較早出現(xiàn)的炎細(xì)胞，主要負(fù)責(zé)吞噬細(xì)胞的碎片;其次巨噬細(xì)胞還可以產(chǎn)生許多炎前性因子，如:腫瘤壞死因子(TNF)-α，白細(xì)胞介素(IL)-1β，IL-6和IL-8等〔3〕，這些細(xì)胞因子釋放到玻璃體視網(wǎng)膜面，促使細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生和沉著，組成可收縮的視網(wǎng)膜前膜成分。

目前認(rèn)為PVR是眼組織損傷后的一種超常炎癥和修復(fù)反應(yīng)。巨噬細(xì)胞在損傷修復(fù)過程中是必需的，它分泌多種細(xì)胞因子和生物活性物質(zhì)，刺激炎癥反應(yīng)，調(diào)控組織修復(fù)。在PVR眼的玻璃體液和視網(wǎng)膜下液內(nèi)檢測(cè)到多種細(xì)胞因子和生長因子，在PVR膜上也檢測(cè)到許多因子的受體，其中許多因子都是由巨噬細(xì)胞分泌的〔4，5〕。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，巨噬細(xì)胞分泌的物質(zhì)有促進(jìn)纖維增生和血管再生的功能，巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)液有類似于表皮生長因子(EGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血小板源性生長因子(PDGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、胰島素樣生長因子(IGF)-I等幾種細(xì)胞因子促進(jìn)RPE細(xì)胞增生〔6〕的作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，玻璃體注入巨噬細(xì)胞可導(dǎo)致牽引性視網(wǎng)膜脫離，加快PVR形成，巨噬細(xì)胞參與了炎癥、免疫和損傷修復(fù)等病理過程。因而，巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是PVR中細(xì)胞增生的必要條件。

RPE細(xì)胞增殖并形成膜是PVR形成的原因，RPE細(xì)胞是PVR視網(wǎng)膜前膜最重要的細(xì)胞成分。在正常生理狀態(tài)下，RPE細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)(G0期)不發(fā)生增殖;在PVR形成過程中，RPE細(xì)胞從原位靜止的狀態(tài)進(jìn)入細(xì)胞周期并開始增殖，發(fā)生了一系列改變:RPE細(xì)胞遷移、增生、形態(tài)變化、產(chǎn)生并表達(dá)多種蛋白、合成細(xì)胞外基質(zhì)、纖維瘢痕化等。使RPE細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期的刺激信號(hào)還不清楚，可能與細(xì)胞間的相互作用產(chǎn)生了誘發(fā)細(xì)胞增生的分子信號(hào)及自分泌，以及對(duì)生長因子反應(yīng)增強(qiáng)等因素有關(guān)。因此，以細(xì)胞周期阻滯為著眼點(diǎn)，將RPE細(xì)胞阻滯在G0期，阻止其重新進(jìn)入細(xì)胞周期，從而抑制細(xì)胞增殖的發(fā)生，可能是抑制PVR形成的有效途徑。

研究表明PEDF是依賴年齡以及細(xì)胞周期特異性轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞因子〔7〕，PEDF的表達(dá)與細(xì)胞增殖密切相關(guān)。在G0期細(xì)胞中PEDF mRNA的表達(dá)和蛋白質(zhì)的分泌明顯高于快速增殖的細(xì)胞，PEDF可以抑制細(xì)胞進(jìn)入DNA合成期(S期)，使細(xì)胞停滯在G0期，從而阻斷有絲分裂、細(xì)胞增生，誘導(dǎo)分化發(fā)生〔8〕。

本研究結(jié)果表明，巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基可誘導(dǎo)RPE細(xì)胞的增殖，而重組hPEDF基因修飾則可以抑制巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞的增殖作用。提示PEDF可能在PVR形成過程中起到一定的抑制作用，但其具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。

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