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    生黃合劑對大鼠心肌缺血再灌注損傷的干預(yù)作用

    2013-11-20 08:28:26閆文翠張維娜高玉峰張鳳英承德護理職業(yè)學(xué)院河北承德067000
    中國老年學(xué)雜志 2013年23期
    關(guān)鍵詞:合劑空白對照心肌細胞

    閆文翠 王 晶 張維娜 高玉峰 張鳳英 李 欣 (承德護理職業(yè)學(xué)院,河北 承德 067000)

    心肌缺血再灌注損傷(MIRI)是心肌缺血后在一定時間內(nèi)恢復(fù)血供,缺血心肌發(fā)生的更嚴重的損傷。MIRI的可能機制有氧化應(yīng)激損傷、鈣超載、炎癥反應(yīng)、細胞凋亡等,如何減輕MIRI一直是醫(yī)學(xué)界研究的熱點。生黃合劑由黃芩莖葉總黃酮和生脈飲組成。前期實驗研究證明〔1~4〕,生黃合劑具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗炎、抗病毒等作用,黃芩莖葉總黃酮與生脈飲具有交互作用,二者合用的效果優(yōu)于單獨使用。本實驗觀察生黃合劑預(yù)處理對大鼠MIRI的影響,探討生黃合劑對心肌保護作用的機制。

    1 材料與方法

    1.1 藥品及試劑 黃芩莖葉總黃酮(由承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所提供,采用黃芩莖葉大孔吸附樹脂提取法,純度為61.8%,批號:010608)、生脈飲(北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠,批號:1261143)、復(fù)方丹參滴丸(天津天士力制藥股份有限公司,批號:110602)。肌酸激酶(CPK)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒購自南京建成生物工程研究所,酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒購自北京四正柏生物科技有限公司,TUNEL試劑盒購自河北博海生物工程有限公司,DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

    1.2 動物分組、給藥及模型制備

    1.2.1 動物分組及給藥 健康SD大鼠48只,雌雄各半,體重250~300 g,北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部提供〔合格證號:SCXK(京)2006-0008〕。隨機分為6組,空白對照組、模型組、陽性藥物組、生黃合劑低、中、高劑量組,每組8只??瞻讓φ战M、模型組灌等體積生理鹽水,陽性藥物組給予復(fù)方丹參滴丸(135 mg/kg)、低、中、高劑量組分別給予不同劑量的生黃合劑(黃芩莖葉總黃酮17.5、35、70 mg/kg均加入5 ml/kg生脈飲溶解),均按0.5 ml/100 g灌胃,1次/d,給藥7 d。給藥結(jié)束后,除空白對照組(冠脈前降支僅穿線不結(jié)扎)外其他組均建立MIRI模型。

    1.2.2 MIRI模型制備 大鼠用4%水合氯醛腹腔注射麻醉(1 ml/100 g),取仰臥位固定,用針形電極插入大鼠四肢皮下記錄標準肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖。頸部正中切口,氣管插管,接人工呼吸機。于胸骨左緣3~4肋間切開胸壁,暴露心臟,在左心耳與肺動脈之間結(jié)扎左冠狀動脈前降支,同時在結(jié)扎線與血管之間穿一直徑2 mm、長5 mm的硅膠管,結(jié)扎30 min;然后剪斷結(jié)扎線,取出硅膠管,再灌注2 h,空白對照組僅穿線不結(jié)扎,同步監(jiān)測肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖。以左心室前壁發(fā)紺和同步心電圖Ⅱ?qū)?lián)ST段抬高為結(jié)扎成功標志,以左心室前壁由發(fā)紺漸變紅潤及ST段降低1/2為再灌注標志〔5〕。

    1.3 指標檢測

    1.3.1 血清CPK、AST、LDH活性的測定 再灌注結(jié)束后經(jīng)心臟采血,4 000 r/min離心10 min,分離血清,置于-20℃冰箱備用,待血清收齊后嚴格按試劑盒說明書要求檢測血清CPK、AST、LDH的含量。

    1.3.2 心肌組織TNF-α含量的測定 采血后立即取出心臟,在結(jié)扎線以下剪取左心室前壁心肌,其中1/2心肌用10%甲醛固定,石蠟包埋,用于細胞凋亡的檢測;另外1/2心肌放入液氮中保存,用于TNF-α的測定。標本收齊后取1 g凍存的心肌,制作組織勻漿,按ELISA試劑盒說明測定各組心肌組織中TNF-α的含量。

    1.3.3 心肌細胞凋亡的檢測 按TUNEL試劑盒說明書檢測心肌細胞凋亡。光學(xué)顯微鏡下觀察,正常心肌細胞核呈藍色,凋亡細胞核呈深淺不一的棕黃色。每例切片隨機選取5個400倍視野,分別計數(shù)每個視野的凋亡細胞和細胞總數(shù),以細胞凋亡指數(shù)(AI)作為凋亡程度的指標,取5個視野AI的均值。AI=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

    1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用SNK法。

    2 結(jié)果

    2.1 各組大鼠血清中CPK、AST、LDH含量測定 模型組血清CPK、AST、LDH含量高于空白對照組(P<0.05);與模型組比較,各組藥組能明顯降低大鼠血清CPK、AST、LDH的含量(P<0.05);生黃合劑高劑量組比低、中劑量組及陽性藥物組降低作用明顯(P<0.05)。見表1。

    2.2 各組大鼠心肌組織TNF-α含量的測定 模型組心肌組織TNF-α含量高于空白對照組(P<0.05);與模型組比較,各用藥組能明顯降低大鼠心肌組織TNF-α含量(P<0.05),其中以生黃合劑高劑量組作用較為明顯,與陽性藥物組、生黃合劑低、中劑量組比較差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

    2.3 心肌細胞凋亡情況的檢測 與空白對照組比較,模型組大鼠心肌細胞凋亡指數(shù)明顯升高(P<0.05);與模型組比較,各用藥組心肌細胞凋亡指數(shù)降低(P<0.05);生黃合劑高劑量組心肌細胞凋亡指數(shù)低于生黃合劑低、中劑量組(P<0.05),但高劑量組與陽性藥物組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1、圖 1。

    表1 各組大鼠CPK、AST、LDH、TNF-α含量及AI的比較 (n=8,s)

    表1 各組大鼠CPK、AST、LDH、TNF-α含量及AI的比較 (n=8,s)

    與空白對照組比較:1)P<0.05;與模型組比較:2)P<0.05;與高劑量組比較:3)P<0.05

    組別 CPK(kU/L)AST(U/L)LDH(kU/L)TNF-α(pg/g)AI(%)空白對照組 1.98±0.14 264.69±19.09 3.53±0.29 353.53±18 20/0.000 266.587/0.000.15 4.30±1.87模型組 4.20±0.191) 637.52±14.561) 4.12±0.111) 905.20±19.211) 34.82±1.451)陽性藥物組 3.34±0.112)3) 457.67±23.752)3) 3.67±0.192)3) 678.33±24.762)3) 21.23±1.652)生黃合劑低劑量組 3.76±0.202)3) 474.74±18.982)3) 3.74±0.252)3) 837.67±23.622)3) 31.51±2.132)3)生黃合劑中劑量組 3.39±0.182)3) 460.83±21.312)3) 3.68±0.212)3) 655.33±17.572)3) 26.71±2.012)3)生黃合劑高劑量組 2.41±0.192) 358.96±15.682) 3.49±0.312) 548.33±21.522) 20.81±1.962)F/P值 172.32/0.000 114.83/0.000 22.13/0.000 494.

    圖1 各組大鼠心肌細胞凋亡TUNEL染色觀察(×400)

    3 討論

    MIRI時,心肌細胞內(nèi)的CK、AST、LDH因釋放而減少,血清中CK、SAT、LDH活性增加,所以測定血清中 CK、SAT、LDH 活性能反映心肌組織損傷程度。本研究顯示,生黃合劑能顯著降低血清中CK、SAT、LDH的活性,減輕MIRI程度。

    TNF-α主要由單核巨噬細胞分泌,是一種主要的炎癥細胞因子,在MIRI過程中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)〔6〕TNF-α與MIRI關(guān)系密切。TNF-α能增加內(nèi)皮細胞黏附分子的表達,增強中性粒細胞與內(nèi)皮細胞的黏附,通過促進中性粒細胞釋放自由基和一些細胞毒性物,直接損害心肌細胞。本研究提示TNF-α參與缺血再灌注損傷的發(fā)生,生黃合劑能顯著降低心肌組織中的TNF-α水平,MIRI后引起的機體TNF-α水平升高的機制有待進一步探討。

    研究〔7〕發(fā)現(xiàn)細胞凋亡在缺血再灌注過程中發(fā)揮著重要作用,特別是在大腦和心臟。細胞凋亡的多少決定著缺血再灌注心肌損傷的嚴重程度,有效抑制細胞凋亡是促進缺血再灌注后心功能恢復(fù)和減輕心肌損傷的重要途徑之一。近年來研究〔8,9〕發(fā)現(xiàn),藥物預(yù)處理可抑制心肌細胞凋亡,降低心肌梗死面積〔10〕,對缺血再灌注心肌細胞具有保護作用。本研究表明生黃合劑有抑制心肌細胞凋亡的作用,與龔明玉等〔8,9〕研究結(jié)果一致。

    綜上,生黃合劑預(yù)處理對缺血再灌注損傷大鼠心肌具有保護作用,以生黃合劑高劑量組效果最明顯,其作用機制可能通過抑制心肌細胞凋亡和CK、SAT、LDH的釋放,降低心肌組織中的TNF-α水平實現(xiàn)的。

    1 張鳳英,高玉峰,宋鴻儒.黃芩莖葉提取物與生脈飲抗柯薩奇病毒B3的體外研究〔J〕.天津醫(yī)藥,2005;33(11):716-8.

    2 高玉峰,張鳳英,米術(shù)斌.生黃合劑對病毒性心肌炎小鼠的干預(yù)實驗〔J〕.中國臨床康復(fù),2006;10(35):51-3.

    3 郭亞春,周曉春,宋鴻儒,等.黃芩莖葉總黃酮與生脈飲對病毒性心肌炎心臟細胞因子mRNA表達的影響〔J〕.山東醫(yī)藥,2008;48(2):46-8.

    4 周曉春,顏 勇,王寶忠,等.生黃合劑對病毒性心肌炎小鼠血清SOD活性和MDA含量的影響〔J〕.承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2008;25(1):10-1.

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    8 龔明玉,張 力,杜 超,等.燈盞素對缺血再灌注損傷大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)及細胞凋亡的影響〔J〕.中國實驗方劑學(xué)雜志,2010;16(5):147-9.

    9 龔明玉,周曉慧,張 力,等.燈盞素抑制大鼠心肌缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的細胞凋亡〔J〕.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2011;17(5):517-9.

    10 路萌萌,于 玲,張桐菲,等.曲古菌素A對心肌缺血再灌注損傷大鼠的保護作用〔J〕.中國實驗方劑學(xué)雜志,2011;17(5):197-9.

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