針刺放血法對抑郁模型大鼠行為學、海馬齒狀回基質(zhì)細胞衍生因子-1免疫陽性細胞及其腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子mRNA表達的影響

羅 強 謝洪武 徐放明 陳日新 (重慶醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，重慶 40006)

目前，抑郁癥是醫(yī)學研究領(lǐng)域的新熱點，雖然其發(fā)病機制尚未清楚，但普遍認為抑郁癥的主要發(fā)病誘因是慢性應(yīng)激，發(fā)病過程伴情緒、學習和記憶等認知功能的損害〔1〕。海馬的易受損傷性在各種應(yīng)激所致疾病中起到至關(guān)重要的作用〔2〕。因此，基于齒狀回是海馬認知功能方面的重要區(qū)域、海馬苔蘚纖維的軸突出芽在認知功能方面的重要作用〔3〕及基質(zhì)細胞衍生因子-1(SDF-1)具有軸突的引導和延伸的雙重調(diào)節(jié)功能〔4〕，而腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)屬于神經(jīng)營養(yǎng)因子家族，促進成年海馬齒狀回神經(jīng)干細胞(NPCs)增殖，維持新生神經(jīng)元存活，調(diào)控海馬神經(jīng)重塑，參與神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)形成，保護受損神經(jīng)元〔5〕;我們嘗試聯(lián)系抑郁模型大鼠的行為學與海馬齒狀回SDF-1免疫陽性細胞及其BDNF mRNA三者來探究針刺放血法治療抑郁癥可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物為清潔級SD成年雄性大鼠30只，體重(220±30)g，由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供。合格證號：SCXK(渝)2011-0001。

1.2 方法 將30只大鼠在重慶醫(yī)科大學動物房飼養(yǎng)1 w，室溫22～24℃，濕度60%，明暗周期為12/12 h，自由飲水、飲食;期間，訓練大鼠飲用蔗糖水，測定蔗糖水消耗和曠野試驗(OFT)基線值。1 w后選擇評分相近的大鼠，隨機分為3組：正常組10只，模型組10只，實驗組10只。正常組繼續(xù)原條件飼養(yǎng)3 w，模型組和實驗組則在單籠孤養(yǎng)和慢性不可預(yù)見溫和應(yīng)激(CUMS)的條件下飼養(yǎng)：①禁食、禁水22 h;②禁水18 h;③傾斜鼠籠45°18 h;④濕籠(150 g木屑加250 ml水)22 h;⑤4℃游泳6 min;⑥持續(xù)光照18 h;⑦水平振蕩6 min;⑧行為限制3 h;⑨夾尾1 min。共9種刺激，每天以抓鬮的方法隨機采取1種，共安排3 w時間;其中2 w后，實驗組大鼠隔日予以針刺放血雙側(cè)太沖穴(依據(jù)《實驗針灸學》動物選穴標準)：針刺工具采用天津華鴻醫(yī)材有限公司生產(chǎn)的漢醫(yī)牌一次性針灸針，型號為0.25 mm×25 mm;選取雙側(cè)太沖穴后用2%的碘酒棉球消毒，再用75%酒精消毒脫碘，單手進針法直刺雙側(cè)太沖穴約2～5 mm，每次治療時間10 min，每次行針持續(xù)10 s。針刺結(jié)束后，于原穴處點刺放血(即古稱“刺血絡(luò)”、“刺絡(luò)”)，工具采用蘇州環(huán)球針灸醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)的環(huán)球牌小號三棱針，型號為￠1.60×65 mm;操作方法為三棱針點刺法，一次一側(cè)放血0.05～0.20 ml，共治療4次。

1.3 大鼠行為學評價 (1)蔗糖水實驗：模型組與實驗組分別在單籠孤養(yǎng)和慢性不可預(yù)見溫和應(yīng)激前、應(yīng)激后第7、14、21天進行糖水消耗試驗，以檢測大鼠對獎賞的反應(yīng)性。實驗過程時，大鼠于安靜動物房單籠飼養(yǎng)，10 h禁食禁水后，同時給予1%蔗糖水和純水各一瓶，30 min后調(diào)換蔗糖水和純水的位置，60 min后取走兩瓶并稱重。計算動物的糖水消耗比例(糖水消耗比例=糖水消耗量/總液體消耗量×100%)。(2)OFT：模型組和實驗組分別于單籠孤養(yǎng)和慢性不可預(yù)見溫和應(yīng)激前、應(yīng)激后第 7、14、21天行 OFT。敞箱裝置由木板制成，底面為60 cm×60 cm的正方形并被等分為16個等邊方格，高50 cm。將大鼠置于中心方格內(nèi)，觀察其5 min內(nèi)穿越格數(shù)(四爪均進入的方格方既可記數(shù)，該項為水平運動得分)和后肢直立次數(shù)(兩前爪騰空或攀附木板，為垂直運動得分)，此兩項得分總和為該鼠的OFT評估指標。

1.4 海馬齒狀回免疫組化檢測 先將大鼠升主動脈灌生理鹽水，然后灌注體積分數(shù)為4%的多聚甲醛，取腦，上升梯度蔗糖過夜，恒冷箱冰凍切片，片厚為15 μm。免疫組化超敏法，S-P試劑盒購于Neo Markers公司。免疫組化實驗步驟：微波抗原修復(fù)，高火6 min。切片滴加過氧化酶阻斷劑，室溫20 min;滴加正常非免疫動物血清，室溫20 min;棄血清，滴加兔抗SDF-1(1∶500)抗體，置于濕盒中，4℃過夜。滴加生物素標記羊抗兔IgG，室溫10 min;滴加鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶溶液，室溫10 min，以上各步驟后都用0.01 mol/L PBS洗3次，每次3 min。DAB顯色3～8 min。常規(guī)脫水、透明和中性樹膠封片。替代實驗，以與一抗血清同濃度的正常羊血清代替一抗進行免疫組織化學染色，結(jié)果陰性。

1.5 海馬齒狀回實時熒光定量PCR(Realtime-PCR)實驗 處死動物后，用醫(yī)用解剖鏡分離，取出大鼠海馬齒狀回，將組織破碎后，用Triziol法提取總RNA，然后用逆轉(zhuǎn)錄酶mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。構(gòu)建聚合酶體系(上游引物：5'_AAG GGC CAG GTC GATTAGG-3';下 游 引物：5'_GAA CAG GAC GGA AAC AGAACG-3'，Primer Premier5.0 設(shè)計)。Taq酶(Promega)催化。熱循環(huán)：95℃預(yù)熱6 min，40個循環(huán)(94℃，20 s;退火20 s;72℃，30 s)。各樣品目的基因和管家基因分別進行SYBR熒光實時定量PCR反應(yīng)，檢測BDNF受體mRNA表達水平。

1.6 數(shù)據(jù)分析 ①光學顯微鏡下放大200倍，觀察各組大鼠海馬齒狀回SDF-1免疫陽性細胞在形態(tài)學變化。②將全部數(shù)據(jù)輸入計算機，運用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)用s表示，所有指標進行正態(tài)性檢驗后選擇檢驗方法。糖水消耗比例、OFT評分用單因素方差分析，組間比較用Bonferroni法。

2 結(jié)果

2.1 蔗糖水試驗結(jié)果 與正常組比，模型組和實驗組大鼠在應(yīng)激后第7、14天的時間，糖水消耗比例均顯著減少(P＜0.01);但實驗組在應(yīng)激后第21天的時間，糖水比例較前升高(P＜0.05)，模型組則大致保持原比例(P＞0.05)。見表1。

表1 各組大鼠應(yīng)激前后不同時期蔗糖水消耗比例評估( s ，n=10，%)

表1 各組大鼠應(yīng)激前后不同時期蔗糖水消耗比例評估( s ，n=10，%)

與正常組比較：1)P＜0.01;2)P＜0.05，下表同

組別 應(yīng)激前 應(yīng)激第7天 應(yīng)激第14天 應(yīng)激第21天正常組75±5 74±5 73±6 73±7模型組 74±6 55±41) 30±81) 32±6實驗組 73±6 54±31) 31±71) 40±32)

2.2 OFT結(jié)果 與正常組相比，模型組和實驗組大鼠在應(yīng)激后第7、14天的時間，水平活動與垂直活動的得分總和顯著降低(P＜0.01);但實驗組應(yīng)激后第21天的時間，水平活動和垂直活動的得分總和較前增多(P＜0.05)，模型組則大致保持原得分總和(P＞0.05)。見表2。

表2 各組大鼠應(yīng)激前后不同時期OFT水平和垂直活動得分評估( s ，n=10)

表2 各組大鼠應(yīng)激前后不同時期OFT水平和垂直活動得分評估( s ，n=10)

組別 應(yīng)激前 應(yīng)激第7天 應(yīng)激第14天 應(yīng)激第21天正常組60±12 58±15 59±14 56±18模型組 62±10 35±101) 18±131) 20±12實驗組 64±14 32±131) 16±121) 28±132)

2.3 各組大鼠海馬齒狀回BDNF mRNA表達結(jié)果 見圖1。與正常組比較，模型組和實驗組的大鼠海馬齒狀回BDNF mRNA表達均下降(P＜0.05)，尤以模型組顯著(P＜0.01)。

圖1 各組大鼠海馬齒狀回BDNF mRNA表達比較圖

2.4 大鼠海馬齒狀回SDF-1免疫陽性細胞的形態(tài)分布結(jié)果①正常組大鼠海馬齒狀回SDF-1免疫陽性細胞的胞體呈圓形或橢圓形并且有一個至多個突起，胞核較大，胞漿呈黃色或棕黃色，數(shù)量較少，免疫陽性細胞沿齒狀回顆粒細胞層規(guī)律性地分布，具有向同一方向聚集的趨勢。②模型組大鼠海馬齒狀回SDF-1免疫陽性細胞的胞體呈圓形或橢圓形空泡狀，胞核小，胞漿呈淺黃色，數(shù)量多，免疫陽性細胞沿齒狀回顆粒細胞層無規(guī)則地分布，無固定的聚集趨勢。③實驗組大鼠海馬齒狀回SDF-1免疫陽性細胞的胞體呈圓形或橢圓形并且有一個至多個突起，胞核適中，胞漿呈黃色，數(shù)量適中，免疫陽性細胞沿齒狀回顆粒細胞層無規(guī)則地分布，具有一定的聚集趨勢。見圖2。

圖2 各組大鼠海馬齒狀回SDF-1免疫陽性細胞形態(tài)分布(DAB，×200)

3 討論

抑郁癥即中醫(yī)郁證，其病因病機文獻早有記載。肝氣郁結(jié)，氣機失調(diào)是本病之根〔6，7〕;疏通調(diào)理肝脈是關(guān)鍵〔8〕。本實驗獨取太沖為治療穴，因該穴系肝經(jīng)原穴，是人體生命活動的原動力，為十二經(jīng)脈維持正常生理功能之根本〔9〕。正如《靈樞·九針十二原》：“五臟有疾也，應(yīng)出十二原，十二原各有所出，明知其原，睹其應(yīng)而知五臟之害矣?！笨梢?，原穴往往調(diào)控著該經(jīng)的總體氣血。實驗中模擬應(yīng)激因子的多變性和不可預(yù)見性而成功造抑郁模型大鼠，本質(zhì)上較為真實地反映抑郁癥病人的某些癥狀和病因。實驗過程中，抑郁模型大鼠的行為學評分相對正常組明顯下降，但實驗組經(jīng)針刺放血治療后，其行為學評分較前明顯升高，由此證實針刺放血法在治療抑郁癥方面的確切療效。

本實驗結(jié)合大鼠海馬齒狀回SDF-1免疫陽性細胞及其BDNF mRNA表達情況進行抑郁癥生理病理基礎(chǔ)和抗抑郁治療方面的研究，整個實驗的結(jié)果支持抑郁癥的“神經(jīng)營養(yǎng)學說”，即抑郁癥的發(fā)生主要與神經(jīng)突出可塑性的損害相關(guān)〔10〕，一定程度上解釋抑郁癥的延遲效應(yīng)〔11〕;而針刺放血法等抗抑郁治療則可通過增強海馬齒狀回SDF-1免疫陽性細胞的表達，促使其海馬苔蘚纖維軸突的出芽，調(diào)控大鼠BDNF激活腦內(nèi)氧化抗氧化系統(tǒng)等信號轉(zhuǎn)導通路從而達到治療抑郁癥的目的。目前，針灸治療抑郁癥，更多的研究其可提高腦內(nèi)5-HT的水平〔12〕，增強中樞NE、5-HT的代謝，協(xié)調(diào)它們之間的關(guān)系，調(diào)整海馬腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達，保護海馬細胞神經(jīng)元〔13〕?？傊樉闹委熞钟舭Y是多方向，多靶點的綜合效應(yīng)，不僅可以緩解抑郁情緒，還可以通過整體調(diào)節(jié)作用改善飲食、睡眠等多系統(tǒng)癥狀，與西藥同用還可減輕藥物副作用。因此針灸治療抑郁癥必將受到越來越多的關(guān)注與研究，為其臨床療效提供更多的理論依據(jù)。

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