替米沙坦、瑞舒伐他汀對胰島素抵抗大鼠骨骼肌小窩蛋白1、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4表達的影響

王艷軍 杜 強 褚雙艷 趙 颯 肖 悅

(中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院內(nèi)分泌科 ，遼寧 沈陽 110004)

胰島素抵抗(IR)是糖尿病(DM)的重要發(fā)病機制，貫穿于DM發(fā)生、發(fā)展的全過程，同時IR也是高血壓、高血脂、肥胖、動脈粥樣硬化的共同病理生理基礎〔1〕。骨骼肌為外周組織IR的主要靶位，長期高糖高脂飲食可引起骨骼肌對胰島素敏感性的降低，導致IR。小窩蛋白1(Caveolin1)是Caveolae的特異性蛋白，胰島素受體、內(nèi)皮型一氧化氮合酶、Src家族酪氨酸激酶等許多信號分子可能集中或定位在Caveolae上，葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4(GLUT4)是骨骼肌主要的跨膜轉(zhuǎn)運蛋白，介導胰島素刺激下葡萄糖的攝取。大量研究發(fā)現(xiàn)Caveolin1及GLUT4與IR密切相關，替米沙坦類藥物及他汀類藥物可減輕IR。本研究應用替米沙坦、瑞舒伐他汀對IR大鼠進行干預，通過RT-PCR方法檢測IR大鼠骨骼肌組織中Caveolin 1、GLUT4的表達水平，探討其在IR發(fā)生中的作用及意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Wistar雄性大鼠48只(中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供)，4周齡，體重80～90 g，單籠飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度25℃左右，濕度50%左右。明暗周期為12 h，自由飲水和進食。

1.2 主要試劑及儀器 RT-PCR試劑盒和Trizol總RNA提取試劑購自大連TaKaRa寶生物技術有限公司;DNA Marker采用TakaRa公司DL2000;Uv-120型(日本)紫外分光光度計測定RNA純度;美國Gelwork 2000圖像掃描系統(tǒng)進行圖像分析。

1.3 PCR引物 Caveolin1(擴增片段為451 bp)：上游：5'-CCCCAAGCATCTCAACGA-3';下 游：5'-ACGGCTGTGATAGCAACT-3';GLUT4(擴增片段為 372 bp)：上游：5'-AGCCTACGCCACCATA-3';下游：5'-CCATAGCATCCGCAAC-3';βactin(擴增片段為 214 bp)：上游：5'-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3'，下游：5'-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3'。

1.4 IR大鼠模型的建立及分組 48只Wistar雄性大鼠適應性飼養(yǎng)1 w，隨機分為正常對照組14只、高糖高脂組34只。正常對照組給予基礎飼料：總熱量為：400 Kcal/100 g;高糖高脂組給予高糖高脂飼料：每100 g高糖高脂飼料中含基礎飼料60 g，豬油15 g，蔗糖25 g。喂養(yǎng)8 w，建立IR模型，隨機抽取兩組大鼠各4只進行高胰島素-正常葡萄糖鉗夾實驗，證明IR存在。將高糖高脂組剩余30只大鼠隨機分為高糖高脂組、替米沙坦組和瑞舒伐他汀組各10只，正常對照組剩余10只為正常對照組。高糖高脂組、替米沙坦組和瑞舒伐他汀組繼續(xù)高糖高脂飼料喂養(yǎng)，正常對照組繼續(xù)基礎飼料喂養(yǎng);同時高糖高脂組給予生理鹽水5 ml·kg－1·d－1灌胃，替米沙坦組給予替米沙坦粉(勃林格英格翰公司惠贈)50 mg·kg－1·d－1加入生理鹽水溶解后灌胃，瑞舒伐他汀組給予瑞舒伐他汀粉(阿斯利康公司惠贈)10 mg·kg－1·d－1加入生理鹽水溶解后灌胃，灌胃時間為每日上午8～9時，繼續(xù)喂養(yǎng)8 w。

1.5 IR評估 于16 w末分別對4組大鼠進行高胰島素-正常葡萄糖鉗夾實驗。大鼠禁食12～14 h，大鼠麻醉后仰臥位固定，頸部正中切口分離右頸靜脈和左頸動脈，分別插入靜脈留置針并縫合固定。頸靜脈通路用于輸注胰島素和葡萄糖，頸動脈通路用于取血標本和肝素鹽水抗凝。術畢靜止30 min后抽取動脈血0.5 ml測定基礎血糖和血清胰島素水平，經(jīng)靜脈輸液泵恒定的注入速效胰島素(6.0 mU·kg－1·min－1)(諾和諾德公司)。每5 min經(jīng)動脈采血10 μl測定血糖(葡萄糖氧化酶電極法，BIOSEN5030，德國產(chǎn))，根據(jù)血糖值調(diào)整葡萄糖(10%)的輸入速度，使血糖維持于基礎值(血糖±0.5 mmol/L)的水平，如此過程經(jīng)過120 min，后60 min的血糖值和葡萄糖的輸入速度都進入穩(wěn)定期，計算60～120 min的葡萄糖輸注率(GIR)，作為受試個體的胰島素敏感性的指標。GIR(mg·kg－1·min－1)=穩(wěn)定期葡萄糖的平均輸入速度(ml/h)60(h換算為min)×10%(葡萄糖濃度)÷體重(kg)。動脈采血進行生化檢測。以GIR降低，且差別有統(tǒng)計學意義作為判定IR模型成功的標準。

1.6 標本采集 大鼠處死，解剖取其骨骼肌，立即－80℃冰箱中保存，以用于PCR檢測。

1.7 RT-PCR 提取總RNA取骨骼肌組織100 mg研磨成粉末至1.5 ml離心管中，加入Trizol 1 ml充分混勻，室溫靜置5 min，加入 0.2 ml氯仿，劇烈搖動 30 s，4℃ 冰箱靜置 10 min，12 000 r/min，4℃離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5 ml離心管中，加入等體積的異丙醇，充分混勻，4℃冰箱靜置10 min，12 000 r/min，4℃離心15 min，可見管底有白色沉淀，棄上清，加入75%冰乙醇(DEPC水處理過)1 ml，輕輕上下顛倒洗滌，12 000 r/min，4℃離心5 min，棄上清，將沉淀室溫下干燥5～10 min，加入 Free Water20 ～40 μl使其溶解，立即 －80℃保存或立即反轉(zhuǎn)錄。紫外分光光度計測量A(260 nm)/A(280 nm)，以確定所提取RNA的純度，所有實驗樣品要求比值在1.8～2.0之間，以保證提取的RNA純度。

RT-PCR 反應反轉(zhuǎn)錄(10 μl體系)：MgCl22 μl，dNTP 混合物 1 μl，10 × RT-緩沖液 1 μl，RNase 抑制劑 0.25 μl，AMV Reverse Transcriptase 0.5 μl，Oligo dT-Adaptor Primer 0.5 μl，RNase Free dH2O 3.75 μl，實 驗 樣 品 RNA 1 μl。反 應 條 件：42℃20 min，99℃ 5 min，5℃ 5min。聚合酶鏈反應(PCR，50 μl體系)：5 × PCR 緩沖液 10 μl，TaKaRa Ex Taq HS 0.25 μl，上游PCR 引物 0.5 μl，下游 PCR 引物 0.5 μl，滅菌蒸餾水 28.75 μl，加入反轉(zhuǎn)錄反應液 10 μl。Caveolin1反應條件：94℃ 3 min，94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 50 s，72℃ 7 min，35 個循環(huán);GLUT4反應條件：94℃ 3 min，94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 50 s，72℃7 min，35 個循環(huán);β-actin 反應條件：94℃ 3 min，94℃ 30 s，56℃30 s，72℃ 50 s，72℃ 7 min，35個循環(huán)。電泳及圖像處理 2.0%瓊脂糖凝膠于120 mV、35 min進行電泳，使用美國 Gelwork 2000圖像掃描系統(tǒng)，以每個樣本的灰度值與參照物灰度值的比值進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié)果

2.1 高胰島素-正常葡萄糖鉗夾實驗結(jié)果 給藥前高糖高脂組血糖水平、血清胰島素水平高于正常對照組(P＜0.05)，GIR低于正常對照組(P＜0.05)。見表1。給藥8 w后，瑞舒伐他汀組及替米沙坦組血糖及血清胰島素水平低于高糖高脂組，但高于正常對照組(P＜0.05)，瑞舒伐他汀組及替米沙坦組GIR高于高糖高脂組但低于正常對照組(P＜0.05)。見表2。

表1 給藥前各組大鼠血糖、胰島素、GIR的變化( s ，n=4)

表1 給藥前各組大鼠血糖、胰島素、GIR的變化( s ，n=4)

與正常對照組比較：1)P＜0.05

組別 血糖(mmol/L)胰島素(ng/ml)GIR(mg·kg－1·min －1)正常對照組5.140±0.076 1.440±0.075 14.970±0.744高糖高脂組 5.598±0.1451)2.360±0.1621) 9.03±0.3331)

表2 給藥后各組血糖、胰島素、GIR的變化( s ，n=10)

表2 給藥后各組血糖、胰島素、GIR的變化( s ，n=10)

1)與正常對照組比較，2)與高糖高脂組比較：均P＜0.05，下表同

5.406±0.143 1.154±0.111 14.061±0.420瑞舒伐他汀組 5.571±1.7891)2) 2.636±0.1541)2) 12.527±0.7941)2)替米沙坦組 5.700±0.2451)2) 2.634±0.1611)2) 11.927±0.8501)2)高糖高脂組 6.015±0.3561) 3.229±0.0611) 7.735±0.1281)1)正常對照組

2.2 一般情況及生化檢查結(jié)果 給藥前(喂養(yǎng)8 w末)，高糖高脂組體重、膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)水平均高于正常對照組(P＜0.05)。見表3。給藥8 w后，瑞舒伐他汀組及替米沙坦組體重、TC、TG均低于高糖高脂組但高于正常對照組(P＜0.05)。見表4。

表3 給藥前各組大鼠體重、TC、TG的變化( s ，n=4)

表3 給藥前各組大鼠體重、TC、TG的變化( s ，n=4)

組別 體重(g)TC(mmol/L)TG(mmol/L)正常對照組243.928±18.146 1.005±0.061 0.634±0.125高糖高脂組 266.246±10.0631)1.135±0.0871) 0.853±0.0771)

表4 給藥后各組體重變化、TC、TG的變化( s ，n=10)

表4 給藥后各組體重變化、TC、TG的變化( s ，n=10)

組別 體重(g)TC(mmol/L)TG(mmol/L)281.239±14.238 1.194±0.074 0.818±0.052瑞舒伐他汀組 298.253±13.7021)2) 1.396±0.0421)2)1.116±0.1651)2)替米沙坦組 305.780±15.8301)1.560±0.0761)2)1.270±0.0561)2)高糖高脂組 313.636±11.7721)2.664±0.0651)1.769±0.1021)正常對照組

2.3 給藥后各組Caveolin1、GLUT4的表達 高糖高脂組骨骼肌中Caveolin1mRNA的表達顯著高于正常對照(P＜0.05)，替米沙坦組及瑞舒伐他汀組大鼠骨骼肌中Caveolin1mRNA的表達較高糖高脂組下降(P＜0.05)，替米沙坦組較瑞舒伐他汀組比較差異無顯著性(P＞0.05)。見圖1，表5。高糖高脂組大鼠骨骼肌中GLUT4 mRNA的表達顯著低于正常對照組(P＜0.05)，替米沙坦組及瑞舒伐他汀組大鼠骨骼肌中GLUT4 mRNA表達較高糖高脂組升高(P＜0.05)，替米沙坦組較瑞舒伐他汀組比較差異無顯著性(P＞0.05)。見圖2，表5。

圖1 各組大鼠Caveolin1 mRNA表達水平比較

表5 各組大鼠骨骼肌Caveolin1、GLUT4與β-actin灰度值比值比較( s，n=10)

表5 各組大鼠骨骼肌Caveolin1、GLUT4與β-actin灰度值比值比較( s，n=10)

0.082±0.031 1.288±0.609高糖高脂組 0.435±0.1751) 0.517±0.3341)2)替米沙坦組 0.241±0.0891)2) 0.943±0.3251)瑞舒伐他汀組 0.193±0.0711)2) 0.950±0.3441)-actin正常對照組組別 Caveolin1/β-actin GLUT4/β

圖2 各組大鼠GLUT4表達水平比較

3 討論

IR是指機體對一定量胰島素的生物學反應低于預計正常水平的一種現(xiàn)象，表現(xiàn)為肝臟、肌肉、脂肪等外周組織對葡萄糖的代謝障礙。大量研究顯示高糖高脂飲食與肥胖及IR相關〔2，3〕。高脂飲食可引起血脂代謝紊亂及骨骼肌攝取葡萄糖能力減少，進而使胰島素刺激的葡萄糖利用度下降，這可能是高脂飲食導致IR的機制。本研究結(jié)果提示高糖高脂飲食可引起IR，高糖高脂飲食與IR、肥胖等相關。

伴隨對IR病理生理機制研究的深入，胰島素信號傳導通路受到特別關注。胰島素首先與細胞膜上的胰島素受體結(jié)合，激活其β亞基的酪氨酸蛋白酶，酪氨酸蛋白酶激活胰島素受體底物(IRS)，引起胰島素受體和IRS的蛋白磷酸化，繼而激活磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、ras蛋白活化絲裂原蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase MAPK)、CAP/Cb1/Tc10途徑，刺激GLUT4轉(zhuǎn)位，增加細胞表面GLUT4的表達，促進肌細胞等對葡萄糖的攝取，從而調(diào)節(jié)糖脂代謝。小凹結(jié)構是細胞質(zhì)膜向內(nèi)凹陷所形成的囊泡狀結(jié)構，主要由脂類和蛋白質(zhì)組成，小窩蛋白是小凹結(jié)構的特異蛋白，也是其發(fā)揮生理功能的關鍵蛋白，Caveolin1是Caveolin家族的重要成員，其分子量為21～24 kD。Caveolin1參與信號轉(zhuǎn)導、膽固醇運輸、胞吞和胞內(nèi)運輸、血管生成等過程。研究發(fā)現(xiàn)許多信號分子如胰島素受體、酪氨酸激酶家族成員、一氧化氮合酶受體、G蛋白耦聯(lián)受體等都可能在Caveolins上的集中或定位〔4〕，而Caveolin1陰性小鼠無論給高脂飲食或是普通飲食均出現(xiàn)IR〔5〕，以上研究提示Caveolin1可能與IR相關。也有研究顯示高脂飲食可上調(diào)Caveolin1的表達〔6〕，DM血管病變時Caveolin1表達增加。GLUT4是一種膜轉(zhuǎn)運蛋白，分子量為45～55 kD，是主要的葡萄糖運載體，僅在胰島素敏感的骨骼肌、心肌和脂肪細胞中表達。由細胞膜上的GLUT4介導的葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運，是骨骼肌利用葡萄糖的主要限速步驟，GLUT4轉(zhuǎn)位障礙、表達或活性下降影響骨骼肌等對葡萄糖的攝取及利用，是導致骨骼肌IR的可能機制〔7〕。研究發(fā)現(xiàn)胰島素受體磷酸化異常、PI3K活性下降等均可影響GLUT4轉(zhuǎn)位，高糖高脂飲食可下調(diào)GLUT4表達，并減弱由胰島素刺激的GLUT4轉(zhuǎn)位及葡萄糖攝取。同時有研究認為GLUT4可能定位在Caveolae上，也有研究認為Caveolin介導了GLUT4的內(nèi)吞作用〔5〕，提示 GLUT4與 Caveolin有關。本研究提示 IR大鼠Caveolin1表達升高，GLUT4表達下降。替米沙坦是血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑的一種。研究顯示腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)過度激活可影響胰島素分泌，干擾胰島素信號傳導，AngⅡ是RAS的關鍵成分，AngⅡ?qū)е翴R的可能機制是AngⅡ抑制胰島素刺激的IRS的酪氨酸磷酸化、減弱PI3K活性、影響GLUT4的轉(zhuǎn)位從而減少機體對葡萄糖的利用〔8〕。替米沙坦類藥物可能通過拮抗AngⅡ作用，同時擴張血管增加骨骼肌等對葡萄糖的攝取，減少氧化應激保護胰島細胞，刺激胰島素分泌等，直接或間接改善 IR。本研究結(jié)果提示替米沙坦可改善 IR，調(diào)節(jié)GLUT4、Caveolin1表達，此結(jié)果與 Shiuchi等〔9〕報道纈沙坦增強骨骼肌胰島素敏感一致。瑞舒伐他汀為3-羥-3-甲基戊二酸單酰輔酶還原酶抑制劑，大量研究顯示他汀類藥物可能通過減弱胰島素受體及IRS等胰島素信號蛋白的絲氨酸磷酸化，增加酪氨酸殘基磷酸化、激活PI3K、影響GLUT4轉(zhuǎn)運，減少游離脂肪酸生成等改善IR，也有研究顯示他汀類藥物可減少Caveolin1水平而促進內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的活性，增加一氧化氮的產(chǎn)生，間接改善IR〔10〕。本研究提示瑞舒伐他汀可調(diào)節(jié)GLUT4、Caveolin1表達，改善IR。推測替米沙坦類、他汀類藥物可能通過調(diào)節(jié)血脂、血糖，減少Caveolin1表達、升高GLUT4表達，促進胰島素信號傳導從而提高模型大鼠的胰島素敏感性，改善IR，可能成為防治DM的新的研究方向。

1 Ahre'n B，Pacini G.Islet adaptation to insulin resistance：mechanisms and implications for intervention〔J〕.Diabetes Obesity Metab，2005;7(1)：2-8.

2 Hema S，Bagry MD.Metabolic syndrome and insulin resistance〔J〕.Anesthsiology，2008;108(5)：506-23.

3 Morrison CD，Huypens P.Implications of crosstalk between leptin and insulin signaling during the development of diet-induced obesity〔J〕.Biochim Biophys Acta，2009;1792(5)：409-16.

4Krajewska WM，Mas¨oowska I.Caveolins：structure and function in signal transduction〔J〕.Cell Mol Biol Lett，2004;9(2)：195-220.

5 Cohen AW，Combs TP.Role of caveolin and caveolae in insulin signaling and diabetes〔J〕.Am J Physiol Endocrinol Metab，2003;285(6)：E1151-60.

6 Hahn Obercyger M，Graeve L，Madar Z.A high cholesterol diet increases the association between caveolae and insulin receptors in rat liver〔J〕.Lipid Res，2009;50(1)：98-107.

7 Charron MJ，Katz EB，Olson AL.GLUT4 gene regulation and Manipulation〔J〕.Biol Chem，1999;274：3253-6.

8 Horiuchi M，Mogi M，Iwai M，et al.Signaling crosstalk angiotensinⅡ re-ceptor subtypes and insulin〔J〕.Endocr J，2006;53(1)：1-5.

9 Shiuchi T，Iwai M，Li HS，et al.Angiotensin Ⅱ type 1 receptor blocker valsartan enhances insulin sensitivity in skeletal muscles of diabetic mice〔J〕.Hypertension，2004;43(5)：1003-10.

10 Feron O，Dessy C，Desager JP，et al.Hydroxy-methylglutaryl-coenzyme A reductase inhibition promotes endothelial nitric oxide synthase activation through a decrease in caveolin abundance〔J〕.Circulation，2001;103(1)：113-8.