LKB1蛋白在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義

李作生 王國臣 陳志全 鄭貿(mào)根 侯靜樸 (河北聯(lián)合大學附屬醫(yī)院胸心外科，河北 唐山 063000)

LKB1即絲氨酸-蘇氨酸激酶11(STK11)，是Peutz-Jeghers綜合征(PJS)的致病基因。有研究認為，LKB1基因突變在肺癌中非常普遍〔1，2〕，LKB1在肺癌發(fā)生、發(fā)展、分化和轉(zhuǎn)移中起著非常重要的作用〔3〕。但目前對LKB1蛋白表達情況與非小細胞肺癌的相關(guān)性研究少見報道。本文應用免疫組化方法對非小細胞肺癌病人的癌組織及正常肺組織的LKB1蛋白表達情況進行研究，分析LKB1的蛋白表達在非小細胞肺癌中的意義。

1 材料與方法

1.1 標本來源 選取2007～2010年河北聯(lián)合大學附屬醫(yī)院胸外科手術(shù)治療并經(jīng)病理確診的非小細胞肺癌76例(腺癌、鱗癌各38例，高分化腫瘤33例，中-低分化腫瘤43例)。其中男性54例，女性22例;年齡56～78歲，平均年齡66歲。所有病例術(shù)前未行放化療。

1.2 取材處理 所有癌組織均取自癌腫原發(fā)灶，避開壞死、炎癥區(qū)域;正常組織取自距癌腫邊緣5 cm以上的正常肺組織(經(jīng)病理檢查證實無轉(zhuǎn)移)。

1.3 免疫組化染色及主要試劑 采用免疫組化非生物素即用型二步法。非生物素即用型二步法染色嚴格按照試劑盒說明書操作，DAB顯色，蘇木精復染，中性樹膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對照。實驗用一抗為鼠抗人LKB1單克隆抗體ab15095，為美國Abcam公司產(chǎn)品。二抗為辣根過氧化物酶標抗鼠-兔聚合物，與即用型免疫組化 EliVision plus試劑盒(鼠-兔)均為福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司產(chǎn)品。

1.4 結(jié)果判定 采取雙盲法閱片，由兩位病理學專家觀察病理切片。判斷細胞染色的強度時要求這些著色顆粒清晰可見并定位準確，而且背景清晰。染色深淺需與背景著色相對比。每張切片至少觀察4個視野，對所測部位進行準確定位后，由攝像系統(tǒng)提取數(shù)值化細胞圖像，再用電腦進行形態(tài)學分析。LKB1蛋白位于細胞質(zhì)、細胞核內(nèi)，顯示為棕黃色顆粒。陽性標準(按陽性細胞所占百分比)：≥25%為表達陽性。

1.5 統(tǒng)計學分析 應用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析。LKB1表達與臨床特征的關(guān)系用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 LKB1在肺癌組織及正常肺組織中的表達 LKB1蛋白在肺癌組織及癌旁正常肺組織中均有表達，其陽性染色呈棕黃色顆粒彌漫性分布于細胞質(zhì)和細胞核。圖1顯示LKB1呈棕黃色顆粒。LKB1在肺癌組織中表達的陽性率為65.79%，在正常肺組織的陽性表達率為90.78%，兩者比較差異有顯著性意義(χ2=13.973，P=0.000)。

2.2 LKB1在肺腺癌和鱗癌中的表達 LKB1蛋白在肺鱗癌組織中的表達陽性率為66.16%，在肺腺癌組織中的表達陽性率為68.42%;兩者比較無顯著差異(χ2=0.234，P=0.629)。

2.3 LKB1表達與腫瘤分化程度的關(guān)系 LKB1蛋白在高分化腫瘤中的表達陽性率(81.82%)明顯高于中-低分化腫瘤(53.49%)(χ2=6.658，P=0.010)。

2.4 LKB1表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系 LKB1蛋白在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組的陽性表達率為52.08%，而在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性表達率(89.29%)明顯高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組(χ2=10.875，P=0.001)。

圖1 肺癌及癌旁組織LKB1蛋白表達(DAB，×200)

3 討論

LKB1基因位于人染色體19p，其功能主要是使細胞周期阻滯在G1期、促進細胞凋亡和調(diào)節(jié)胚胎血管形成等。LBK1蛋白具有絲/蘇氨酸蛋白激酶活性，通過磷酸化底物蛋白或與靶蛋白結(jié)合，調(diào)控基因表達，參與細胞周期調(diào)控、細胞凋亡等生命活動〔4，5〕。LKB1幾乎在人的所有組織中均有表達。LKB1基因的突變見于各種病理類型的肺癌〔1～3，6，7〕。2002 年 Sanchez-Cespedes實驗室首先報道了在肺腺癌中存在相當比例的LKB1功能性缺失突變〔8〕。之后 Matsumoto等〔7〕通過對非小細胞肺癌中腺癌的大規(guī)模測序分析亦得出類似結(jié)論。Koivunen等〔9〕通過對北美以及東亞原發(fā)性肺癌標本的研究得出北美人群相對于東亞人群存在較多的LKB1突變率，以及腺癌多于鱗癌的特點。這些研究提示LKB1的體細胞突變在肺癌發(fā)生、發(fā)展中起著非常重要的作用。LKB1基因的改變常和其他重要的腫瘤基因突變包括KRAS和TP53并存，尤其是LKB1基因改變經(jīng)常與另外一個位于染色體19p的腫瘤抑制基因BRG1失活同時發(fā)生〔10，11〕，說明肺癌的發(fā)生是多種腫瘤基因共同作用的結(jié)果。

本研究結(jié)果說明在腺癌和鱗癌中均存在LKB1基因異常導致的LKB1蛋白表達的異常。本實驗結(jié)果顯示LKB1蛋白隨著腫瘤分化程度的降低其表達陽性率也下降，可能提示LKB1蛋白的低表達導致其對腫瘤的抑制作用減弱，從而導致腫瘤的惡性程度升高。本實驗結(jié)果也顯示出LKB1蛋白表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，LKB1蛋白低表達者容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，說明LKB1蛋白表達下調(diào)也可能減弱了其對肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的抑制能力。這些研究結(jié)果說明LKB1具有抑癌作用，其機制可能與其對 VEGF 的調(diào)控有關(guān)〔12，13〕，LKB1 能夠下調(diào) VEGF 的表達，從而抑制腫瘤新生血管產(chǎn)生，達到抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。

1 Osoegawa A，Kometani T，Nosaki K，et al.LKB1 mutations frequently detected in mucinous bronchioloalveolar carcinoma〔J〕.Jpn J Clin Oncol，2011;41(9)：1132-7.

2 Gill RK，Yang SH，Meerzaman D，et al.Frequent homozygous deletion of the LKB1/STK11 gene in non-small cell lung cancer〔J〕.Oncogene，2011;30(35)：3784-91.

3 Ji HB，Ramsey MR，Hayes DN，et al.LKB1 modulates lung cancer differentiation and metastasis〔J〕.Nature，2007;448(7155)：807-10.

4 Karuman P，Gozani O，Odze RD，et al.The Peutz Jegher gene product LKB1 is a mediator of p53 dependent cell death〔J〕.Mol Cell，2001;7(6)：1307-19.

5 Tiainen M，Ylikorkala A，Makela TP.Growth suppression by Lkb1 is mediated by a G(1)cell cycle arrest〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1999;96(16)：9248-51.

6 Amin RM，Hiroshima K，Iyoda A，et al.LKB1 protein expression in neuroendocrine tumors of the lung〔J〕.Pathology International，2008;58(2)：84-8.

7 Matsumoto S，Iwakawa R，Takahashi K，et al.Prevalence and specificity of LKB1 genetic alterations in lung cancers〔J〕.Oncogene，2007;26(40)：5911-8.

8 Sanchez-Cespedes M，Parrella P，Esteller M，et al.Inactivation of LKB1/STK11 is a common event in adenocarcinomas of the lung〔J〕.Cancer Res，2002;62(13)：3659-62.

9 Koivunen JP，Kim J，Lee J，et al.Mutations in the LKB1 tumour suppressor are frequently detected in tumours from Caucasian but not Asian lung cancer patients〔J〕.Br J Cancer，2008;99(2)：245-52.

10 Sanchez-Cespedes M.The role of LKB1 in lung cancer〔J〕.Fam Cancer，2011;10(3)：447-53.

11 Rodriguez-Nieto S，Sanchez-Cespedes M.BRG1 and LKB1：tales of two tumor suppressor genes on chromosome 19p and lung cancer〔J〕.Carcinogenesis，2009;30(4)：547-54.

12 Safe S，Abdelrahim M.Sp transcription factor family and its role in cancer〔J〕.Eur J Cancer，2005;41(16)：2438-48.

13 臧遠勝，夏天保，李 強.抑癌基因LKB1對肺癌細胞血管內(nèi)皮生長因子的表達調(diào)控〔J〕.第二軍醫(yī)大學學報，2007;28(6)：624-8.