云南白藥對豚鼠缺血心肌的保護作用

劉歆陽 王智超 李曉丹 陸 燁 嚴鈺鋒

（1復旦大學基礎醫(yī)學院07級臨床醫(yī)學八年制1班，醫(yī)學實驗教學中心 上海 200032）

隨著生活質量和醫(yī)療條件的改善，人類壽命逐漸延長，而老年疾病尤其是心血管病的病死率和死亡率也呈上升趨勢。根據我國流行病學調查，冠心病和腦卒中發(fā)病率與死亡率在增加，平均每年以5%的速度遞增［1］。在心血管疾病中，缺血性心肌病，包括粥樣硬化所導致的冠狀動脈狹窄或梗阻，占有相當大的比重，嚴重危害人群健康。

缺血性心肌病是中老年常見多發(fā)的后天性心臟病。舌下含服硝酸甘油可有效擴張冠狀動脈，緩解心肌缺血性損傷，可作為急救藥品對家庭突發(fā)性缺血性心臟病有良好的保護作用。然而，對于沒有心血管疾病家族史的家庭，很少有儲備硝酸甘油。

云南白藥至今已有近百年歷史，其憑借良好的止血、活血化瘀、抗炎等作用被廣泛應用于內科、外科、婦科、兒科、五官科、皮膚科等多種疾病的治療［2］，為我國多數家庭常備藥。已有研究表明云南白藥的主要成分三七有改善心肌缺血的作用［3］，但云南白藥對心肌缺血的保護作用目前尚無報道。本實驗研究云南白藥對心肌缺血的保護作用，探究云南白藥能否為家庭中突發(fā)性缺血性心臟病患者提供一種急救措施。

本研究應用垂體后葉素復制豚鼠急性心肌缺血動物模型［4］，以硝酸甘油干預為陽性對照，以生理鹽水干預為陰性對照，通過比較心電圖改變、對比組織學改變和亞細胞結構改變、對比大體缺血面積等方法研究云南白藥對心肌缺血的保護作用。

材料和方法

實驗材料

試劑與儀器 豚鼠手術臺、哺乳動物手術器械、豚鼠用心電圖生物轉換器、生物信號記錄儀、伊文氏藍（復旦大學基礎醫(yī)學院功能學實驗室提供）；垂體后葉素、硝酸甘油（上海市第一生化制品有限公司）；云南白藥（云南省云南白藥有限公司）。

實驗動物 清潔級豚鼠30只，雌雄不限，體質量（400±30）g，由復旦大學實驗動物中心提供。隨機分為5組，每組6只，分別是N組（正常組，生理鹽水對照）、ADH組（垂體后葉素腹腔注射造模）、NO組（造模后經硝酸甘油解救）、LD組（造模后經低濃度云南白解救）和HD組（造模后經高濃度云南白藥解救）。

實驗方法

模型建立與給藥劑量 豚鼠急性心肌缺血模型用腹腔注射0．5U／kg垂體后葉素建立。在心電圖出現心肌缺血表現后立即給予藥物解救。硝酸甘油和低濃度云南白藥給藥劑量由成人用藥量換算得到（以成人用藥量分別為5μg／kg，成人平均體質量60 kg，人與豚鼠轉換系數5．55計算），分別為27．75 μg／kg和3．6mg／kg。高濃度云南白藥給藥量為36 mg／kg。兩種藥物均溶于生理鹽水，每只動物注射總量為0．5mL。

蘇木精－伊紅切片染色 解救成功后即處死豚鼠，取出心臟。豚鼠心肌組織經常規(guī)10%甲醛溶液固定，制成石蠟切片，蘇木精－伊紅染色后光鏡觀察。光鏡照片為同一視野下的400倍圖像。心肌染色組織切片由復旦大學基礎醫(yī)學院病理學系協助制作。

心電圖分析 在注射垂體后葉素完成后開始計時，心電圖在1min內每15s記錄1次，1～5min之間，每30s記錄1次。記錄急性心肌缺血發(fā)生時間和持續(xù)長短。正常豚鼠的ST段大多位于等電位線上，T波均為正向［5］，急性心肌缺血時心電圖形態(tài)的改變主要為ST段上移和T波高聳。急性心肌缺血心電圖出現時間和持續(xù)的長短都是評價急性心肌缺血模型建立成功與否和藥物干預是否有效的特征性指標［6］。起效時間定義為從注射硝酸甘油或云南白藥到心電圖恢復正常的時間。

心肌梗死面積計算 心電圖記錄完畢后立即處死豚鼠，去除心房組織及脂肪，將左心室心肌橫切4～5片，對心肌行TTC（伊文氏藍）染色，將心肌放入含有10g／L TTC的PBS（pH7．4）溶液中孵育10min。TTC染色區(qū)（深藍色）示仍存活的心肌組織，非TTC染色區(qū)（灰白色）即梗死區(qū)。拍照后將圖片由專人打亂編號，由另一位不知編號代表組別的分析人員勾畫染色區(qū)與非染色區(qū)以避免期望偏倚，用圖像分析軟件Photoshop可計算梗死區(qū)域所占面積百分比。

結 果

豚鼠心電圖分析 各組豚鼠心電圖表現見圖1ADH組豚鼠注射垂體后葉素后，心電圖出現T波抬高的心肌缺血表現，而N組無改變，提示造模成功。注入解救藥物后，NO組心肌缺血癥狀明顯緩解，T波回復正常，平均起效時間為（13．0±6．2）s。云南白藥解救組亦有解救效果，T波回復正常歷時較長，低劑量組平均起效時間為（81．3±13．9s高劑量組平均起效時間為（46．0±14．0）s。差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0．05，圖2），提示云南白藥對急性心肌缺血具有解救作用且解救作用與劑量濃度正相關，但作用時間較硝酸甘油更長。

圖1 各組心電圖表現Fig 1 ECG of each group

圖2 NO組、LD組、HD組對ADH的解救時間Fig 2 Resuce time for ADH of NO，LD and HD groups

豚鼠心肌梗死面積分析 各組平均值、方差及組間顯著性差異的檢驗見圖3。N組與ADH組差異顯著表明急性心肌缺血模型建立成功，ADH組與NO組差異顯著提示硝酸甘油緩解心肌缺血效果明顯。ADH組與LD組及ADH組與HD組差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0．05），表明低劑量和高劑量云南白藥都能減少心肌梗死面積。NO組與LD組差異顯著表明LD組解救效果不及硝酸甘油，而NO組與LD組沒有顯著差異，則無證據表明硝酸甘油解救效果優(yōu)于高劑量云南白藥。TTC染色如圖4所示，灰白色即梗死區(qū)。

圖3 各組心肌缺血面積Fig 3 Ischemic area of each group

豚鼠心肌組織切片形態(tài)分析 N組：鏡下示心肌細胞呈短柱狀，彼此平行排列，核1～2個，卵圓形，居中；橫紋不明顯。ADH組：心肌纖維出現明顯腫脹，肌纖維排列稍顯紊亂并伴間質水腫。部分區(qū)域心肌細胞腫脹，細胞核碎裂，有炎性細胞浸潤。NO組：心肌細胞形態(tài)基本正常，排列較為規(guī)則，幾乎接近正常組織。LD組：心肌細胞水腫明顯，有少量壞死細胞與炎癥細胞浸潤。HD組：心肌細胞水腫略有改善，壞死細胞較少（圖5）。

圖4 TTC染色顯示缺血區(qū)域Fig 4 Ischemic Area After TTC Treatment

圖5 各組心肌光鏡圖Fig 5 Micrographs of myocardia in each group

討 論

急性心肌缺血模型評價 經注射垂體后葉素建模后，心電圖在短時間內顯示為T波抬高；心肌組織出現明顯腫脹，排列紊亂伴間質水腫的現象，同時心肌梗死面積比率顯著增大，與其他各組差異較大。功能學和形態(tài)學的指標與心肌缺血時的病理狀態(tài)相吻合，提示心肌缺血模型建立成功。

陽性對照效果評價 NO組的心肌缺血型心電圖在短時間內緩解，且組織形態(tài)學上顯示心肌細胞形態(tài)和排列與N組相似，與ADH組差異較大，提示硝酸甘油對于急性心肌缺血的解救效果明顯。

硝酸甘油為臨床急性心肌缺血解救的常用藥，其療效得到了理論和實踐的長期印證，效果顯著，本實驗中應用硝酸甘油對于急性心肌缺血解救的效果作為陽性對照，評價云南白藥的解救作用。

云南白藥對急性心肌缺血的保護作用 通過LD組、HD組和ADH組的比較，功能學和形態(tài)學的指標都提示云南白藥對于急性心肌缺血有潛在的解救作用。HD組的解救作用在起效快慢、保護作用大小方面都明顯優(yōu)于LD組，提示云南白藥對于急性心肌缺血的解救作用有一定的劑效正相關。LD組和HD組的解救效果都低于陽性對照，說明云南白藥在這兩個濃度的解救效果都弱于硝酸甘油。

本實驗采用的給藥方式是腹腔注射，與云南白藥常用的口服和外用方式不同。但在醫(yī)學動物實驗中，只要給藥劑量換算正確，不同的給藥方式在效果方面是等效的。本實驗以豚鼠為對象，且心肌缺血過程變化迅速，另外實驗中需監(jiān)測豚鼠的心電圖，靜脈注射、口服或外用存在需要移動體位，吸收較慢，創(chuàng)傷性操作，操作復雜等缺點，對心電圖干擾較大，會影響實驗結果的判斷。而腹腔注射能夠快速微創(chuàng)傷性給藥，無需移動豚鼠體位，藥物起效快。有文獻證實［5，7］，針對豚鼠為實驗對象的研究包括藥理學、藥效學、心血管疾病治療方面的研究，多采用腹腔注射的給藥途徑，并能夠得到公認。所以，本實驗腹腔注射得到的結論是可信的。

本實驗中云南白藥選用了高低兩個劑量，其中低劑量由成人正常劑量換算得到。目前對于云南白藥的不良反應及劑量報道較少，有報道稱高劑量口服云南白藥會導致房室傳導阻滯，但僅為少數病例［8］，缺少對其他各種影響因素的全面分析，機制闡述不清。由于云南白藥沒有公認的治療窗，高劑量粗略定為低劑量的10倍，旨在研究云南白藥對心肌缺血的保護作用是否有劑量依賴關系及超大劑量云南白藥是否有明顯的毒性作用。實驗結果表明，10倍劑量的云南白藥給藥后短期內未發(fā)現明顯不良反應。云南白藥治療心肌缺血的最佳濃度及安全的治療窗有待于進一步設計濃度梯度實驗探究。

云南白藥解救心肌缺血的作用機制目前還不明確，有動物實驗表明云南白藥能增加心肌營養(yǎng)性血流［9］。臨床研究發(fā)現在非血運重建急性Q波心肌梗死伴有室壁瘤的患者中，云南白藥可降低患者血清白介素－6、白介素－8和高敏C反應蛋白等炎性介質的水平［10］。另外，云南白藥的主要成分三七中的三七總皂苷有抗血栓形成、改善微循環(huán)、降低心肌耗氧量和減輕再灌注損傷等功能［3］。但云南白藥中各種有效成分如何相互作用、是否協同對抗心肌缺血等問題還有待進一步研究。

致謝 復旦大學基礎醫(yī)學院病理學系張志剛老師以及功能學教學實驗室的各位老師在整個項目的進展過程中給予了幫助與支持。

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［6］ 王飛宇．冠狀動脈供血不足心電圖的幾種表現［J］．中外醫(yī)療，2011，30（2）：188．

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