羅非魚魚鱗明膠微膠囊化抗壞血酸的研究*

李鵬，申鉉日，陶摸，陳婷

(海南大學(xué) 食品學(xué)院，海南?？?，570228)

抗壞血酸(L-ascorbic acid，AA)，俗稱 VC，在食品中被廣泛的作為維生素補(bǔ)充劑和抗氧化劑，對人體代謝過程和生命活動(dòng)的許多方面也具有重要影響;在醫(yī)藥上具有預(yù)防出血、解毒、增強(qiáng)機(jī)體對疾病的抵抗力、降低癌癥的發(fā)生率等作用［1］;還可抑制酪氨酸酶的活性，從而阻止黑色素生產(chǎn)［2］，并能降低紫外線對細(xì)胞的損害，故抗壞血酸對美白膚色、保持皮膚彈性及防止皺紋的產(chǎn)生有一定的效用［3］。但常用的抗壞血酸產(chǎn)品在空氣和水中極不穩(wěn)定，不溶于油相，使其應(yīng)用受到了一定的限制。所以獲得穩(wěn)定有效的抗壞血酸體系一直受到廣泛的關(guān)注［4］。微膠囊技術(shù)因可以在活性物質(zhì)表面形成保護(hù)層，達(dá)到保護(hù)、緩釋活性物質(zhì)的目的，而受到眾多學(xué)者的關(guān)注。通過抗壞血酸微膠囊保護(hù)和緩釋抗壞血酸的研究已有報(bào)道［5－6］，在制藥方面的應(yīng)用的時(shí)間已經(jīng)很長，但在食品方向的發(fā)展最近才興起［7］，且包埋率多不理想，噴霧干燥法獲得的抗壞血酸微膠囊包埋率低于50%［8］，使用糖玻璃化技術(shù)制得的抗壞血酸微膠囊也僅為70%［9］，一些包埋率稍高的微膠囊多為復(fù)合壁材，使用單一壁材獲得較高包埋率的微膠囊尚未見報(bào)道。選擇良好的微膠囊方法，配合合適的微膠囊壁材，將有望改善抗壞血酸微膠囊的包埋率。明膠以其優(yōu)異的理化性能、良好的生物相容性，成為不可多得的微膠囊制備材料。羅非魚魚鱗提取的明膠的開發(fā)利用［10］由于充分利用了廢棄物，提高了羅非魚產(chǎn)品的附加值而倍受關(guān)注。魚類明膠與哺乳動(dòng)物源明膠的性質(zhì)存在差異［11－12］，但該差異對于明膠作為微膠囊壁材而使用的利弊尚無定論。本實(shí)驗(yàn)以羅非魚魚鱗提取的明膠為壁材，通過Tanaka［13］提出的與其他物理化學(xué)方法相比所需設(shè)備簡易、條件溫和的乳化法制備微膠囊。并將該方法與超聲波技術(shù)相結(jié)合，以克服微膠囊粒徑偏大、分布范圍寬的現(xiàn)象。在此基礎(chǔ)上以谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(TG酶)代替通常使用的具有一定毒性的戊二醛［14］作為交聯(lián)劑，以食品用乳化劑山梨醇酐三硬脂酸酯為乳化劑在超聲波作用下制備食用性強(qiáng)的抗壞血酸微膠囊，以期說明該來源明膠在替代哺乳動(dòng)物來源明膠作為微膠囊壁材的可行性，拓展該魚鱗明膠的應(yīng)用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅非魚魚鱗，海南泉溢食品有限公司提供;植物甾醇玉米油，金龍魚有限公司;谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(TG酶)，南寧龐博生物工程有限公司;食品級山梨醇酐三硬脂酸酯，廣州食品添加劑有限公司;L-抗壞血酸，廣州化學(xué)試劑廠;無水乙醇(AR級);明膠，天津市福晨化學(xué)試劑廠;其他試劑均為分析純。

超聲波清洗機(jī)XO-5200DTD，南京先歇儀器有限公司;7200型分光光度計(jì)，尤尼柯上海儀器有限公司;恒溫磁力攪拌器，常州奧華儀器有限公司;Olympus生物顯微鏡，奧林巴斯BX41TF，日本，Olympus公司;水浴鍋H-10002511，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，Winner型激光粒度分析儀，濟(jì)南維納顆粒技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 羅非魚魚鱗明膠的制備

取干羅非魚魚鱗300 g清洗后用體積分?jǐn)?shù)為30%的HCl 1 500 mL浸泡攪拌15 min脫灰，然后用蒸餾水反復(fù)清洗至中性，再將瀝干的魚鱗放入濃度為4 g/L的NaOH溶液中攪拌12 h，除去脂肪和雜蛋白，將清洗后的魚鱗放入1 600 mL蒸餾水中用95℃水浴提取3h，布氏漏斗過濾，濾液經(jīng)冷凍干燥后即獲得水溶性魚鱗明膠。

1.2.2 微膠囊的制備

微膠囊的制備流程如圖1所示。用蒸餾水將羅非魚魚鱗明膠配制成一定濃度溶液并與一定濃度的抗壞血酸溶液混合得到A液，然后將A液用注射器加入到含有一定量乳化劑的玉米油混合液B中。用超聲波處理該AB混合液10 min后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%NaOH將其pH值調(diào)為6.0［15］，在磁力攪拌器的作用下加入1mL谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，攪拌1min后，再加入30mL體積分?jǐn)?shù)50%乙醇，同樣磁力攪拌1min后將樣品至于一定溫度的水浴鍋中，待溶液分層后，去除上層油層，再用10%NaOH將樣品pH值調(diào)為10，維持該pH值滅酶10 min，然后用10%醋酸將pH值調(diào)回7即得到微膠囊乳液。

圖1 羅非魚魚鱗明膠微膠囊包埋抗壞血酸的制備流程Fig.1 The preparation process of Tilapia scale gelatin microcapsules embedded ascorbic acid

1.2.3 抗壞血酸的測定

精密稱取一定量的抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)樣品，配制成0.25 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 mL 該樣液，并分別加入 1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.2、0 mL 的蒸餾水，再向上述總體積為1 mL的溶液中分別加入2.0 mL草酸-EDTA、0.5 mL 偏磷酸-乙酸、1.0mL 硫酸、2.0 mL 5%鉬酸銨溶液，搖勻后，靜置5 min，以蒸餾水為空白在760 nm的波長處測定吸光度。以吸光度(A)對質(zhì)量(m)進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為A=0.002 5m+0.000 5(R2=0.999)，見圖 2。

圖2 抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of Ascorbic acid

1.2.4 未包埋抗壞血酸含量的測定

取1 mL微膠囊化溶液，置于截留分子質(zhì)量為8 000～14 000 Da的透析膜中，透析膜置于含有20 mL蒸餾水的50 mL用錫箔紙包裹的避免外界光線照射的離心管中，離心管于5℃冰箱中放置24 h之后，取透析外液以蒸餾水為空白在760 nm處測定吸光度，根據(jù)抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出未包埋抗壞血酸含量。

1.2.5 微膠囊的評價(jià)

1.2.5.1 微膠囊對抗壞血酸的包埋率

由于不易直接測定明膠對抗壞血酸的包埋率，故采用間接測定的方法。

包埋率/%=(加入抗壞血酸總質(zhì)量－透析外液抗壞血酸質(zhì)量)/加入抗壞血酸總質(zhì)量

本實(shí)驗(yàn)中的計(jì)算公式為:

其中:mAA為實(shí)驗(yàn)過程中加入的抗壞血酸的總質(zhì)量;A760為透析液的吸光值;W1為微膠囊包埋率。

1.2.5.2 玉米油分層的測定

將制備的樣品置于相同的容器中，測定油相析出量隨時(shí)間的變化確定固化時(shí)間對油相析出的影響，確定最佳靜置時(shí)間，確保在最短時(shí)間內(nèi)獲得最佳效果。以樣品所能析出的玉米油的最大體積為分母，不同時(shí)間段所測得的析出玉米油體積為分子，該數(shù)值的百分?jǐn)?shù)作為評價(jià)指標(biāo)，最短時(shí)間內(nèi)，該指標(biāo)值越大，則分層效果越好，越有利于微膠囊的高效制備。

1.2.5.3 微膠囊形貌的測定

通過顯微鏡觀察微膠囊的形狀;并通過本實(shí)驗(yàn)采用Winner型激光粒度分析儀測定所制備微膠囊。選取了平均粒徑以及比表面積對微膠囊進(jìn)行了評價(jià)。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳化劑對包埋率的影響

按照圖1所示制備微膠囊，各參數(shù)值為:羅非魚魚鱗明膠30 mg/mL為壁材，15 mg/mL為芯材，按體積比1∶1混合后得到質(zhì)量比為2∶1的明膠和抗壞血酸得混合液A，含有一定量乳化劑(食品級山梨醇酐三硬脂酸酯)的20 mL玉米油為混合液B，固化劑谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(TG酶)(0.12 g/mL)的添加量為1 mL，40℃水浴的固化時(shí)間為4 h。在此制備條件下對乳化劑用量對包埋率的影響進(jìn)行了探討。所取乳化劑用量為 20，40，60，80，100，120 μL。結(jié)果如圖 3 所示，隨著乳化劑含量的升高，微膠囊的包埋率隨著加入乳化劑體積的增加先增加后降低，呈現(xiàn)拋物線趨勢，且當(dāng)乳化劑用量為100 μL時(shí)，所得的微膠囊包埋率最高為79.46%。

圖3 乳化劑添加量對羅非魚魚鱗明膠微膠囊對抗壞血酸包埋率的影響Fig.3 Emulsifier affect tilapia fish scale gelatin microcapsule embedding rate of ascorbic acid

2.2 微膠囊固化時(shí)間對連續(xù)相分層的影響

在制備微膠囊的過程中，添加TG酶和乙醇后于40℃水浴鍋中靜置，有利于TG酶對魚鱗明膠的交聯(lián)［15］，從而獲得更加穩(wěn)定的微膠囊即完成微膠囊的固化過程。該過程是谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(蛋白質(zhì)-谷氨酸氨基-γ-谷胺酰轉(zhuǎn)移酶，EC2.3.2.13)通過?；D(zhuǎn)移機(jī)理催化蛋白質(zhì)交聯(lián)反應(yīng)，涉及到蛋白結(jié)合的谷氨酰氨(酰胺供體)基和伯胺(酰胺受體)，包括某些蛋白質(zhì)中的賴氨酸殘基中ε-氨基。由谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶催化的蛋白質(zhì)共價(jià)交聯(lián)能夠引起蛋白質(zhì)排列、構(gòu)象、穩(wěn)定性的變化。此過程中，玉米油隨著時(shí)間的推移逐漸析出，將析出的玉米油去除即得到單一的明膠包埋抗壞血酸的微膠囊。在微膠囊制備的整個(gè)流程中，耗時(shí)最長的步驟為40℃的水浴固化，為了在較合適的時(shí)間內(nèi)獲得玉米油的最佳分離效果，本實(shí)驗(yàn)對玉米油析出體積與時(shí)間變化進(jìn)行了測定。結(jié)果顯示(圖4)，隨著固化時(shí)間的增加，連續(xù)相分層逐漸明顯。當(dāng)固化時(shí)間達(dá)到7 h時(shí)已可以將流動(dòng)相很好地分離了。以8 h析出的連續(xù)相量為分母，按照析出玉米油的評價(jià)方法，第7小時(shí)所析出的連續(xù)相已經(jīng)達(dá)到97.99%，此時(shí)已經(jīng)可以很好的將流動(dòng)相去除。故以7h作為制備該微膠囊所需的固化時(shí)間。

圖4 微膠囊固化時(shí)間對羅非魚魚鱗明膠微膠囊對抗壞血酸包埋率的影響Fig.4 The separating time of mobile phase affect tilapia fish scale gelatin microcapsule embedding rate of ascorbic acid

2.3 連續(xù)相玉米油用量對包埋率的影響

玉米油在魚鱗明膠形成微膠囊的過程中，在乳化劑的作用下形成均一體系，有助于微膠囊的形成，該過程可能影響微膠囊的包埋率。而且，在乳化劑含量一定的情況下，乳液的乳化能力應(yīng)該是一定的，則所能夠利用的玉米油體積也可能是有限的，因此，此條件下應(yīng)該存在玉米油的最適用量，以獲得較高的微膠囊包埋率。為了獲得這個(gè)最佳值，本文在前面探頭的基礎(chǔ)上即在乳化劑山梨醇酐三硬脂酸酯為100 μL，固化時(shí)間為7h的條件下，按照圖1制備微膠囊的流程制備微膠囊，對玉米油的用量為 5、10、15、20、30 mL進(jìn)行了探討。結(jié)果如圖5所示。玉米油用量對所形成微膠囊的包埋率確實(shí)存在影響，且當(dāng)玉米油用量小于20 mL時(shí)，包埋率隨著玉米油用量的增加而增加，當(dāng)玉米油用量為20 mL時(shí)，魚鱗明膠微膠囊對VC的包埋率達(dá)到最高，為89.73%。此后玉米油再增加，包埋率反而減小。與推測相符合，故在此條件下，玉米油作為流動(dòng)相的最佳用量為20 mL。

2.4 明膠與抗壞血酸比例對包埋率的影響

羅非魚魚鱗明膠作壁材包埋抗壞血酸時(shí)，在一定情況下形成的微粒子數(shù)量是有限的，因此在制備的過程中，還應(yīng)該探討一定量明膠所能包埋抗壞血酸的最佳值。故對抗壞血酸用量與微膠囊包埋率進(jìn)行了探討。在乳化劑用量為100 μL，固化時(shí)間為7 h，玉米油用量為20 mL的情況下分別探討了抗壞血酸質(zhì)量為明膠質(zhì)量的0.25、0.5、1、2、3倍時(shí)，所形成微微膠囊的包埋率。結(jié)果如圖6所示。當(dāng)抗壞血酸質(zhì)量為明膠質(zhì)量的0.5倍即兩者質(zhì)量比為1∶2時(shí)，所得到微粒子的包埋率最大，為89.73%。大于或小于該比例均會(huì)導(dǎo)致包埋率下降。故選擇魚鱗明膠與抗壞血酸的質(zhì)量比為2∶1。至此，獲得制備微膠囊的最佳條件。

圖5 玉米油用量對羅非魚魚鱗明膠微膠囊對抗壞血酸包埋率的影響Fig.5 Mobile phase of corn oil affect tilapia fish scale gelatin microcapsule embedding rate of ascorbic acid

圖6 對羅非魚魚鱗明膠微膠囊對抗壞血酸包埋率的影響Fig.6 The mass ratio of ascorbic acid and gelatin affect tilapia fish scale gelatin microcapsule embedding rate of ascorbic acid

2.5 動(dòng)物明膠與羅非魚魚鱗明膠對于微膠囊包埋率的影響

分別取相同量的動(dòng)物明膠和羅非魚魚鱗明膠，在前面探討獲得的最高包埋率的微膠囊制備條件下，分別制備微膠囊，并比較所得2種微膠囊的包埋率。動(dòng)物明膠所得抗壞血酸微膠囊包埋率為57.3%，該值低于魚鱗明膠所制備的微膠囊的包埋率89.73%。故魚鱗明膠比較適合該方法，并可以通過該方法獲得包埋率相對較高的抗壞血酸微膠囊。

2.6 羅非魚魚鱗明膠包埋抗壞血酸微膠囊的形狀及粒徑分布

通過顯微鏡觀察包埋率最高為89.73%的微膠囊溶液中微膠囊的形貌。如圖7所示，在(100×100)μm的視野內(nèi)含有大量微膠囊，且所得微膠囊為球形。

圖7 羅非魚魚鱗明膠包埋抗壞血酸微膠囊形貌Fig.7 The morphology of tilapia scale gelatin microcapsules embedding ascorbic acid

通過激光粒度分析儀測定了所制備微膠囊的粒徑分布(結(jié)果如圖8所示)。所制備微粒子平均粒徑為3.57 μm，粒徑分布現(xiàn)對較為集中，比表面積為18 139.16 cm2/cm3。

圖8 羅非魚魚鱗明膠包埋抗壞血酸微膠囊的粒徑分布Fig.8 The particle size distribution of the tilapia scale gelatin microcapsules embedding ascorbic acid

3 結(jié)論

使用海南盛產(chǎn)的羅非魚加工下腳料魚鱗提取的明膠作為壁材，20 mL的玉米油為流動(dòng)相，100 μL食品級山梨醇酐三硬脂酸酯為乳化劑，無毒副作用的TG酶為架橋劑，在40℃下固化7 h，15 mg/mL羅非魚魚鱗明膠與抗壞血酸質(zhì)量比為2∶1，制備包埋抗壞血酸的微膠囊為球形，在顯微鏡下觀察不出現(xiàn)凝聚現(xiàn)象，所制備微粒子平均粒徑為3.57 μm，粒徑分布現(xiàn)對較為集中。且以羅非魚魚鱗明膠為壁材可獲得較哺乳動(dòng)物源明膠制備包埋抗壞血酸更高的包埋率，這說明魚鱗明膠在微膠囊中以壁材的形式得到應(yīng)用具有一定的可行性，并具有代替哺乳動(dòng)物源明膠的潛力。

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