板藍(lán)根中多糖提取工藝的研究

張洪杰, 王廣樂

(江蘇科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212003)

板藍(lán)根為常用中藥材,多以菘藍(lán)干燥根入藥．目前全國所用的板藍(lán)根分為兩種:一種為十字花科植物菘藍(lán)的根,在我國北方地區(qū)得到廣泛使用,習(xí)稱“北板藍(lán)”．另一種為爵床科植物馬藍(lán)的根,在華南地區(qū)及西南大部分地區(qū)得到廣泛使用,習(xí)稱“南板藍(lán)”．目前這兩種商品不論在品種或質(zhì)量上,都比較穩(wěn)定[1]．板藍(lán)根具有味苦、性寒、歸心等性質(zhì)．現(xiàn)代臨床廣泛應(yīng)用于預(yù)防和治療各種病毒和細(xì)菌所引起的感冒發(fā)熱、流腦、肝炎、肺炎、扁桃體炎、腮腺炎、急性眼結(jié)膜炎和皰疹皮炎等疾?。逅{(lán)根具有較強(qiáng)的抗病毒活性,是公認(rèn)的抗病毒中藥,同時(shí)它還有抗菌消炎、免疫調(diào)節(jié)、抗內(nèi)毒素、抗癌等作用[2]．板藍(lán)根的主要有效成分有:靛玉紅、靛藍(lán)、多糖、β-谷甾醇、Y-谷甾醇和精氨酸、谷氮酸等各種氨基酸．目前,人們認(rèn)為具有治療作用的活性成分主要存在于靛藍(lán)、靛玉紅和多糖中[3]．多糖的提取一般是根據(jù)其溶解度的不同,選擇不同溫度、不同液料比的稀堿液、水作溶劑．現(xiàn)在人們逐漸將超聲波提取、微波提取、離子交換色譜法和超臨界流體萃取等應(yīng)用于藥用植物有效成分的提取中[4]．

文中用水作提取劑,在單因素基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面法對(duì)浸提時(shí)間,溫度和液料比工藝進(jìn)行全面的研究,為提高板藍(lán)根多糖的提取率,及其后期的開發(fā)應(yīng)用提供參考依據(jù)．

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料和試劑

板藍(lán)根,購于南水橋藥店,安徽產(chǎn)．

葡萄糖、苯酚、無水乙醇、濃硫酸、乙醚等均為分析純．

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

DK-S28電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；FA2004電子天平(上海精密儀器制造廠)；101A-2電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠)；VIS-723分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠)；80-2B離心沉淀機(jī)(上海手術(shù)機(jī)械廠)．

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1) 板藍(lán)根粉末的預(yù)處理 首先采用索氏提取法乙醚回流2～3 h去除可溶性脂類,接著用80%乙醇回流2 h后過濾除去單糖和低聚糖,備用．

2) 顯色液的配制 往50 mL濃H2SO4中緩慢加入10 mL蒸餾水,冷卻至室溫后加入0.6 g苯酚晶體,攪拌溶解,備用．

3) 板藍(lán)根多糖的測(cè)定方法 稱取一定量的已處理好的板藍(lán)根粉末,用水作提取劑,在設(shè)定溫度下提取一定時(shí)間,靜止過濾,殘?jiān)礈?～3次,合并濾液,準(zhǔn)確移取1.0 mL濾液于試管中,加25.0 mL蒸餾水稀釋,作為測(cè)定液．移取1.0 mL測(cè)定液于干凈比色管中,加入5.0 mL顯色液,震蕩混勻后放入沸水浴30～35 min,然后放入冷水浴中冷卻至室溫35 min后,以蒸餾水做空白參比液,于490 nm處測(cè)吸光度．

4) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取100 mg葡萄糖,蒸餾水溶解后定容于100 mL容量瓶中,配成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液．分別移取1.0,2.0,3.0,4.0，6.0，8.0 mL標(biāo)準(zhǔn)液至100 mL容量瓶中定容．分別移取上述溶液1.0 mL于10 mL比色管中,加5 mL顯色液,震蕩混勻,置于沸水浴中,加熱30 min后冷卻至室溫．以蒸餾水做空白參比,于490 nm處測(cè)定吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[5]，可得回歸方程:A=4.702 9C-0.000 3(C為葡萄糖濃度,mg/mL),R2=0.998 6．

5) 葡萄糖質(zhì)量與提取率的計(jì)算

苯酚-硫酸法[5],以葡萄糖為基準(zhǔn)物作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量．

(1)

式中：m為多糖質(zhì)量(g);D(λ)為樣品溶液吸光度;V為過濾后體積(mL);w為稀釋倍數(shù).

(2)

式中：y為多糖提取率(%);m為多糖質(zhì)量(g);M為原料質(zhì)量(g).

6) 提取液波譜分析

準(zhǔn)確稱取5.0 g已處理好的板藍(lán)根粉末,加150 mL蒸餾水,于90 ℃下水浴7 h后過濾,取1.0 mL濾液加25.0 mL蒸餾水稀釋作為待測(cè)液．移取1.0 mL待測(cè)液于10mL比色管中,加5.0 mL顯色液于沸水浴中煮30 min,取出冷卻至室溫,于450～550 nm范圍內(nèi)每隔10 nm測(cè)其吸光度,在490 nm處有最大吸收．

7) 顯色穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取0.04 mg/ mL的葡萄糖溶液于10.0 mL比色管中,加5.0 mL顯色液,于沸水浴中煮30 min,取出冷卻至室溫,在490 nm下每隔5 min測(cè)一次吸光度,考察其顯色穩(wěn)定性(圖1).

圖1 顯色穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)Fig.1 Stability after color test

由圖1可看出,樣品在冷卻后60 min內(nèi)穩(wěn)定性較好,其中20 min內(nèi)吸光度逐漸增加,35 min后趨于穩(wěn)定,因此實(shí)驗(yàn)最好在樣品冷卻至室溫35 min后測(cè)定吸光度．

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 浸提時(shí)間對(duì)板藍(lán)根多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5份5.0 g已處理好的板藍(lán)根粉末于5個(gè)錐形瓶中,液料比為30 ∶1(mL/g),浸提溫度為80 ℃,浸提時(shí)間分別設(shè)置為4，5，6，7和8 h，過濾,殘?jiān)礈?～3次,合并濾液,準(zhǔn)確移取1.0 mL濾液于試管中,加25.0 mL蒸餾水稀釋,測(cè)定相應(yīng)吸光度．根據(jù)式(2)計(jì)算多糖提取率,考察浸提時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響(圖2)．

圖2 時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Fig.2 Effect of time on the extraction of radix isatidis polysaccharide

由圖2可知，在一定范圍內(nèi),隨著浸提時(shí)間的延長,多糖提取率隨時(shí)間的延長而增加;4～7 h內(nèi)多糖提取率增加顯著,7～8 h內(nèi)多糖提取率增加趨勢(shì)變緩．時(shí)間過長會(huì)使多糖的結(jié)構(gòu)破壞,從而影響多糖提取率．

2.1.2 液料比對(duì)板藍(lán)根多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5份5.0 g已處理好的板藍(lán)根粉末于5個(gè)錐形瓶中,控制浸提時(shí)間為7 h,浸提溫度為80 ℃,液料比分別設(shè)置為10 ∶1，20 ∶1，30 ∶1，40 ∶1和50 ∶1 mL/g,過濾,殘?jiān)礈?～3次,合并濾液,準(zhǔn)確移取1.0 mL濾液于試管中,加25.0 mL蒸餾水稀釋,測(cè)定相應(yīng)吸光度．計(jì)算多糖提取率,考察液料比對(duì)多糖提取率的影響,結(jié)果見圖3．

圖3 液料比對(duì)板藍(lán)根多糖提取率的影響Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on extraction of radix isatidis polysaccharide

由圖3可知:在浸提開始階段隨溶劑的增加,板藍(lán)根多糖提取率增加,當(dāng)液料比為30 ∶1時(shí)多糖提取率最大．當(dāng)液料比大于30 ∶1(mL.g-1)時(shí)多糖提取率變化不明顯,說明多糖已基本溶出．從節(jié)約能源角度考慮,選擇較佳液料比30 ∶1．

2.1.3 浸提溫度對(duì)板藍(lán)根多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5份5.0 g已處理好的板藍(lán)根粉末于5個(gè)錐形瓶中,浸提溫度分別設(shè)置為60,70,80,90和100 ℃,設(shè)定液料比為30 ∶1 mL/g,浸提時(shí)間為7 h,過濾,殘?jiān)礈?～3次,合并濾液,準(zhǔn)確移取1.0 mL濾液于試管中,加25.0 mL蒸餾水稀釋,測(cè)定相應(yīng)吸光度．計(jì)算多糖提取率,考察浸提溫度對(duì)多糖提取率的影響(圖4)．

圖4 溫度對(duì)板藍(lán)根多糖提取率的影響Fig.4 Effect of temperature on extraction of radix isatidis polysaccharide

由圖4可知:在60～90 ℃范圍內(nèi),隨溫度升高多糖提取率增加,這是由于溫度升高分子熱運(yùn)動(dòng)加快,多糖的溶出效果增強(qiáng);但當(dāng)溫度達(dá)到100 ℃時(shí)多糖提取率又出現(xiàn)下降趨勢(shì),這是因溫度過高,容易引起多糖的降解,從而導(dǎo)致多糖提取率下降．

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化分析

2.2.1 響應(yīng)面分析因素水平的選取

根據(jù)Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[6-9],綜合2.1單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取液料比、浸提溫度、浸提時(shí)間對(duì)多糖提取率影響顯著的3個(gè)因素,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法．實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1．

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface(RS) test

2.2.2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

以液料比(A)、浸提溫度(B)、浸提時(shí)間(C)為自變量,以多糖提取率為響應(yīng)值(Y),進(jìn)行響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)．實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表2．

表2 響應(yīng)面及實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果Table 2 Results of the RS test

2.2.3 響應(yīng)面方差分析

利用Design-Expert軟件對(duì)表2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,得到各因素與多糖提取率的二次多項(xiàng)回歸模型:Y=9.85-0.27A+1.88B+0.31C-0.72AB+0.75AC-0.54BC-1.39A2-0.83B2+0.90C2;運(yùn)用響應(yīng)面分析法對(duì)所建立的數(shù)學(xué)模型結(jié)果進(jìn)行方差分析,回歸分析結(jié)果見表3．

表3 回歸分析結(jié)果Table 3 Statistical results of regression analysis

回歸方程中各變量對(duì)指標(biāo)(響應(yīng)值) 影響的顯著性是由F值來判定的,p越小,相應(yīng)變量的顯著性就越高．表3中模型的F值為23.21,p值為0.000 2,表明模型是非常顯著的．失擬項(xiàng)不顯著(p值0.103 1),說明該模型是合理的．由p值可知,各因素對(duì)提取率影響的大小順序?yàn)?浸提溫度>浸提時(shí)間>液料比．B，AB，AC，A2，B2和C2的p值小于0.05,對(duì)多糖提取率的影響顯著．A，B，C的交互影響作用大小為AC>AB>BC．R2=0.967 6,則證明該模型可以解釋96.76%響應(yīng)值的變化,說明該模型擬合程度較好,可以用來分析和預(yù)測(cè)多糖提取率．

2.2.4 響應(yīng)面分析結(jié)果繪制3D圖

由圖5可知，當(dāng)液料比較低,浸提溫度較高時(shí),提取率較高,浸提溫度和液料比相互影響明顯;當(dāng)液料比較大時(shí),浸提溫度升高,多糖提取率先增大后又有所減?。?/p>

圖5 Y=f(A, B)的響應(yīng)面和等高線Fig.5 Responsive surfaces and contours of Y=f(A,B)

由圖6可知，多糖提取率隨液料比的增大,先增加后減小,當(dāng)浸提時(shí)間較短時(shí)多糖提取率變化顯著,但隨著浸提時(shí)間的延長,這種變化變得緩慢．液料比和浸提時(shí)間的交互作用顯著．

圖6 Y=f(A, C)的響應(yīng)面和等高線Fig.6 Responsive surfaces and contours of Y=f(A,C)

由圖7可知:在浸提溫度較低時(shí),隨浸提時(shí)間的延長,多糖提取率有增大趨勢(shì);而當(dāng)浸提溫度較高時(shí),多糖提取率隨時(shí)間的延長,先減小后增大．

圖7 Y=f(B,C)的響應(yīng)面和等高線Fig.7 Responsive surfaces and contours of Y=f(B,C)

應(yīng)用Design-Expert軟件分析可知,最優(yōu)條件為:浸提溫度90 ℃、浸提時(shí)間6 h、液料比23.8 ∶1 mL/g,板藍(lán)根多糖提取率為12.56%．根據(jù)實(shí)際調(diào)整: 浸提溫度90 ℃、浸提時(shí)間6h、液料比24 ∶1 mL/g．驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得出實(shí)際提取率為11.92%,與理論值的誤差為0.64%．由此可知,響應(yīng)面優(yōu)化板藍(lán)根多糖提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確,具有實(shí)際可操作性．

3 結(jié)論

1) 各因素對(duì)多糖提取率影響的大小順序?yàn)?浸提溫度>浸提時(shí)間>液料比．

2) 最佳提取工藝條件為:浸提溫度90 ℃、液料比24 ∶1 mL/g、浸提時(shí)間6 h,在此條件下多糖提取率最高,達(dá)到11.92%.實(shí)際提取率與理論值相差較小,說明該模型能夠很好地預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,可以簡單快速地用來設(shè)計(jì)和分析各種與此相關(guān)的實(shí)驗(yàn)．

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