術(shù)前應(yīng)用復(fù)方苦參注射液對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的影響及機(jī)制研究

石曉明 吳勝春 楊永賓 唐 雷 呂柏楠

(河北省人民醫(yī)院普外二科，河北 石家莊 050051)

結(jié)腸癌是臨床常見(jiàn)的惡性消化道腫瘤，近年來(lái)其發(fā)病率、死亡率在國(guó)內(nèi)外均呈上升趨勢(shì)[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療結(jié)腸癌多是手術(shù)為主、輔以化療的綜合治療，但治療效果一直不能令人滿意。近年來(lái)，為改善結(jié)腸癌的治療效果，許多中藥制劑的機(jī)制已得到充分研究，部分藥物已用于臨床并取得了較好的治療效果[1-3]。復(fù)方苦參注射液即是這些中藥制劑中療效比較明確的一種，且該藥物毒副作用較小[4-5]，但迄今關(guān)于苦參對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞作用的效果及機(jī)制研究尚不完全明確。2009-02—2011-10，我們對(duì)22例結(jié)腸癌患者術(shù)前給予復(fù)方苦參注射液，通過(guò)對(duì)手術(shù)及術(shù)后情況觀察，術(shù)后腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特征的檢測(cè)，初步探討了復(fù)方苦參注射液對(duì)結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制，并與術(shù)前未應(yīng)用復(fù)方苦參注射液的結(jié)腸癌患者20例對(duì)照觀察，結(jié)果如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 全部42例均為我院普外科住院患者，隨機(jī)分為2組。治療組22例，男13例，女9例；年齡39～72歲，平均(59.46±11.28)歲。對(duì)照組20例，男11例，女9例；年齡58～74歲，平均(62.19±9.96)歲。2組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 診斷及納入標(biāo)準(zhǔn) 入組所有患者均有明確的結(jié)腸鏡檢查、CT檢查及病理學(xué)活檢診斷。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者本次手術(shù)前均未接受過(guò)放化療等其他治療，患者均不存在絕對(duì)手術(shù)禁忌證，部分患者患有與手術(shù)及麻醉相關(guān)的慢性疾病(如高血壓、心臟病、糖尿病、腎病等)。

1.3 治療方法 2組均于完善術(shù)前檢查并制訂手術(shù)計(jì)劃后擇期手術(shù)。治療組于手術(shù)前予復(fù)方苦參注射液(山西振東制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z14021231)15 mL，加入0.9%氯化鈉注射液250 mL中，每日1次靜脈滴注，連續(xù)給藥5 d。對(duì)照組手術(shù)前不予復(fù)方苦參注射液治療。

1.4 觀察指標(biāo)及方法 手術(shù)后腫瘤組織取出后迅速投入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)入-80 ℃低溫冰箱保存。RNA提取試劑Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒(RT-PCR)購(gòu)自美國(guó)Promega公司；PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤組織細(xì)胞周期及凋亡率 細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶[含0.02%四乙酸乙二胺(EDTA)]溶液消化，4 ℃，500 g離心收集細(xì)胞，沉淀中加入預(yù)冷的70%乙醇1 mL，輕輕吹打，4 ℃固定過(guò)夜。4 ℃，500 g，離心10 min，去上清，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次。然后加入1 mL碘化丙啶(PI)染液將細(xì)胞重懸，4 ℃避光染色30 min后，F(xiàn)ASCalibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)檢測(cè)。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.2 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(QRT-PCR)法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞水通道蛋白1(AQP1)mRNA、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA) mRNA、生存素(Survivin) mRNA的表達(dá) 組織勻漿后，采用一步法常規(guī)方法提取組織總RNA。用美國(guó)Thermo公司 Nandrop 2000/2000C分光光度計(jì)測(cè)定RNA的純度和濃度，并用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性。依照RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求，取RNA 1 μg，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA并建立PCR反應(yīng)體系。建立20 μL PCR反應(yīng)體系：1 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)的模板、2×UltraSYBR Mixture 10 μL、10 μmol/L的上下游引物1 μL、無(wú)DNase-RNase水8 μL。利用熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司Life Techologie 牌7500型定量PCR儀)擴(kuò)增，PCR反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃ 5 min預(yù)變性后，95 ℃ 變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，于每個(gè)循環(huán)的延伸階段采集熒光信號(hào)檢測(cè)目標(biāo)基因與內(nèi)參照基因的熒光強(qiáng)度(以GAPDH為內(nèi)參照基因)。擴(kuò)增完畢后，進(jìn)入結(jié)果分析界面，計(jì)算目的基因表達(dá)的相對(duì)定量值(RQ值)且以此為依據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)所用引物序列如下：AQP1上游引物：5'-GTCCAGGACAACGTGAAGGT-3'，下游引物：5'-GAGGAGGTGATGCCTGAGAG-3'；PCNA上游引物：5'-GTGAATTTGCACGTATATGCCG-3'，下游引物：5'-GCAATTTTATACTCTACAACAAGGGG-3'；Survivin上游引物：5'-CTTTCTCAAGGACCACCGCA-3'，下游引物：5'-GCCTCGGCCATCCGCT-3'。

2 結(jié) 果

2.1 2組手術(shù)及術(shù)后情況比較 見(jiàn)表1。

表1 2組手術(shù)及術(shù)后情況比較

由表1可見(jiàn)，2組手術(shù)及術(shù)后情況比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 2組腫瘤組織細(xì)胞周期及凋亡率比較 見(jiàn)表2。

表2 2組腫瘤組織細(xì)胞周期及凋亡率比較

表2 2組腫瘤組織細(xì)胞周期及凋亡率比較

組 別nG0/G1期S期G2/M期凋亡率治療組2263.9±10.2*22.5±7.513.6±4.4*5.86±2.64*對(duì)照組2055.7±9.826.8±5.417.5±4.63.85±1.98

與對(duì)照組比較，*P<0.05

由表2可見(jiàn)，與對(duì)照組比較，治療組G0/G1期腫瘤組織細(xì)胞增加(P<0.05)，S期、G2/M期腫瘤組織細(xì)胞減少(P<0.05)，凋亡率增高(P<0.05)。

2.3 2組腫瘤組織AQP1 mRNA、PCNA mRNA及Survivin mRNA水平比較 見(jiàn)表3。

表3 2組腫瘤組織AQP1 mRNA、PCNA mRNA及Survivin mRNA水平比較

與對(duì)照組比較，*P<0.05

由表3可見(jiàn)，治療組AQP1 mRNA、PCNA mRNA及Survivin mRNA水平均明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。

3 討 論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，結(jié)腸癌由憂思郁怒，飲食不節(jié)，久痢久瀉，脾失健運(yùn)，氣機(jī)不暢，毒邪侵入，濕熱蘊(yùn)結(jié)，下注大腸，滯留積聚，凝結(jié)成積所致[6]。復(fù)方苦參注射液的主要成分為苦參、茯苓，其中苦參主治濕熱瀉痢、腸風(fēng)便血、濕毒瘡瘍，對(duì)腫瘤有明顯的抑制作用；茯苓清熱利濕，解毒消腫，主治癰腫瘡毒等疾患。復(fù)方苦參注射液在多種惡性腫瘤的治療中已取得了較好的效果，且無(wú)明顯的毒副作用[4-5]。本研究結(jié)果顯示，使用復(fù)方苦參注射液后無(wú)不良反應(yīng)，安全性較好。

本研究進(jìn)一步應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)復(fù)方苦參注射液治療結(jié)腸癌的機(jī)制進(jìn)行了初步探討。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，復(fù)方苦參注射液對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖凋亡具有明顯的調(diào)節(jié)作用。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，應(yīng)用復(fù)方苦參注射液后更多的腫瘤細(xì)胞停留在G0/G1期，且凋亡率升高，說(shuō)明本藥具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制增殖的作用。對(duì)腫瘤細(xì)胞AQP1、PCNA、Survivind的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示腫瘤細(xì)胞AQP1、PCNA、Survivind表達(dá)均明顯降低，提示復(fù)方苦參注射液可通過(guò)調(diào)控這3種基因表達(dá)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，這可能是復(fù)方苦參注射液治療結(jié)腸癌的重要機(jī)制之一。

復(fù)方苦參注射液具有抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡的作用，但還有待進(jìn)一步擴(kuò)大研究規(guī)模以確定其效果，且本藥具體機(jī)制尚待臨床與基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)合進(jìn)行進(jìn)一步深入研究。

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