腎血管性高血壓大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)中介素IMD基因與RAAS的相關(guān)性研究

董 勁，程水泉 (.陜西省漢中市中心醫(yī)院心內(nèi)科，陜西 漢中 73000;.陜西省漢中市中心醫(yī)院呼吸科，陜西 漢中 73000)

腎素血管緊張素系統(tǒng)(RAS)在高血壓血管重塑過程中起了不可忽視的作用，已有實(shí)驗(yàn)表明，AngⅡ可以刺激胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖、肥大，并促進(jìn)其膠原合成。醛固酮(ALD)也可以在血管組織局部合成并可在局部獨(dú)立地調(diào)控血管重塑。

中介素(Intermedin，IMD)又叫腎上腺髓質(zhì)素 2(Adrenomedullin 2，ADM2)，是一種寡G蛋白偶聯(lián)受體oGPCR，自身并無活性，只有當(dāng)他與其受體活化蛋白R(shí)AMPs包括RAMP1、RAMP2、RAMP3才發(fā)揮其降壓、擴(kuò)血管、心臟保護(hù)等作用。

目前為止，曾強(qiáng)發(fā)現(xiàn)IMD和RAMP1、RAMP2、RAMP3在自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)主動(dòng)脈中蛋白和mRNA水平均上調(diào)[1]，說明IMD參與高血壓大血管的重塑。因此，為進(jìn)一步證明IMD在高血壓大鼠血管重塑中的作用，本實(shí)驗(yàn)旨在研究腎血管性高血壓大鼠血管重構(gòu)中IMDmRNA表達(dá)的規(guī)律，及IMD的變化與RAS的激活有無關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 建立腎動(dòng)脈不全結(jié)扎高血壓大鼠模型:選用重280～320 g健康雄性SD大鼠(四川省中醫(yī)藥研究所)。麻醉后動(dòng)物取右側(cè)臥位，分離左腎動(dòng)脈，將直徑為0.22 mm的針灸針放置在左腎動(dòng)脈上[2]，用手術(shù)縫線結(jié)扎，抽出針灸針。假性手術(shù)組分離左腎動(dòng)脈，僅用手術(shù)縫線繞過，不予結(jié)扎。以術(shù)后血壓超過 18.7 kPa(140 mm Hg，1 mm Hg=0.1333 kPa)時(shí)即確定動(dòng)物高血壓形成用于藥物實(shí)驗(yàn)。所有動(dòng)物術(shù)后飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，術(shù)后2周高血壓已初步形成，第4～6周趨于平穩(wěn)。

1.2 血壓測(cè)量:采用RBP_III型大鼠血壓心率儀(中日友好醫(yī)院)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)尾套法在大鼠清醒狀態(tài)下測(cè)定尾動(dòng)脈血壓。測(cè)量前大鼠在34℃下預(yù)熱10～15min。測(cè)量時(shí)間設(shè)置在每天上午8:00～12:00，每只至少進(jìn)行3次測(cè)定，取3次結(jié)果的平均值作為血壓數(shù)值。在術(shù)后第1個(gè)月每周至少測(cè)定血壓一次，以后2周測(cè)定血壓1次。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組:實(shí)驗(yàn)分成五組:①單純不完全結(jié)扎一側(cè)腎動(dòng)脈(高血壓對(duì)照組);②不完全結(jié)扎一側(cè)腎動(dòng)脈加纈沙坦組;③不完全結(jié)扎一側(cè)腎動(dòng)脈加左旋氨氯地平組;④不完全結(jié)扎一側(cè)腎動(dòng)脈加依那普利;⑤假手術(shù)組。以上用藥組于術(shù)后第5周開始分被給纈沙坦30 mg/(kg·d)，左旋氨氯地平2.5 mg/(kg·d)，依那普利 20 mg/(kg·d)，1 次/d，連續(xù)給藥8周。各組藥物劑量的選擇參照文獻(xiàn)[3－5]。以上各組分籠喂養(yǎng)，給藥組分別溶于蒸餾水中通過胃管灌飼給藥。假手術(shù)對(duì)照組及高血壓對(duì)照組給予同等容積的溶劑。對(duì)那些被不完全結(jié)扎但在術(shù)后第4周末血壓仍未升高的大鼠，將在給藥前從藥物實(shí)驗(yàn)中剔除。在給藥時(shí)間結(jié)束之時(shí)，再次測(cè)量動(dòng)物體重和血壓。

1.4 組織分離和標(biāo)本準(zhǔn)備:治療8周末，處死大鼠，分離腹主動(dòng)脈，取從膈肌至第一肋間動(dòng)脈節(jié)段之間的胸主動(dòng)脈，去除動(dòng)脈壁脂肪和結(jié)締組織。將胸主動(dòng)脈截為三段:一段浸入Trizol中迅速用眼科剪剪碎，再用組織勻漿機(jī)勻漿，分別置于－80℃液氮中貯存，用于實(shí)驗(yàn)中mRNA檢測(cè);一段固定在4%多聚甲醛中過夜，行常規(guī)石蠟包埋，以用作胸主動(dòng)脈中膜厚度及中膜截面積測(cè)量;第三段分別用于胸主動(dòng)脈AngⅡ和ALD含量的檢測(cè)。

1.5 主動(dòng)脈中膜厚度及中膜截面積測(cè)量:石蠟包埋主動(dòng)脈組織連續(xù)性切片5張，其切面與血管縱軸垂直。對(duì)這些組織切片進(jìn)行彈力纖維Orcein染色及蘇木素染色。組織切片圖像通過顯微攝像系統(tǒng)轉(zhuǎn)換至電腦中儲(chǔ)存，并采用Version 4.6 spot圖像分析系統(tǒng)測(cè)量主動(dòng)脈中膜層厚度及中膜截面積。以夾在主動(dòng)脈壁內(nèi)、外彈力纖維層之間的環(huán)形區(qū)域?yàn)橹心咏孛?，而?nèi)、外彈力纖維層之間平均距離為中膜層厚度。

1.6 胸主動(dòng)脈血管緊張素Ⅱ含量和醛固酮的檢測(cè):胸主動(dòng)脈經(jīng)稱重后即放入備有0.5 mmol/L乙酸的試管中，入100℃水浴中煮沸 10min，經(jīng)冷卻后進(jìn)行勻漿，4℃離心 20min(3000 r/min)，取上清液，置于－20℃冰箱保存。采用放射免疫法檢測(cè)每克胸主動(dòng)脈AngⅡ和ALD含量的檢測(cè)。藥盒購自北京解放軍總醫(yī)院科技園開發(fā)中心放免所，按試劑盒說明書操作。

1.7 RT－PCR法測(cè)定大鼠胸主動(dòng)脈中IMDmRNA及受體mRNA:總RNA抽提劑(Trizol)購自Gibico公司，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT－PCR)試劑購自Promega公司。IMD及受體引物序列為從國際互聯(lián)網(wǎng)CDNA文庫檢索的原始序列，參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)[6]。六對(duì)引物均由上海生物工程公司合成。胸主動(dòng)脈總RNA提取和IMD及受體CRLR，RAMP1、2、3mRNA的測(cè)定，用Trizol一步法提取胸主動(dòng)脈中總RNA、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶及Oligo(dT)15primer逆轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖電泳分離和溴乙錠染色后，凝膠成像及定量掃描儀分別獲得376bp和446bp條帶，IMD mRNA/β－actin mRNA的光密度比值即為 IMD mRNA的相對(duì)含量。CRLR和RAMPS的PCR反應(yīng)條件，詳見表1。

表1 擴(kuò)增的寡核苷酸引物

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件(SPSS for Windows 13.0)對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，各組數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。組間比較采用單因素方差(One－way ANOVA)分析，Student－Newman－Keuls(SNK)方法檢驗(yàn)，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生理特征:藥物治療8周后Rh大鼠的血壓較其他各組大鼠顯著升高(P＜0.01)，而Rh大鼠的體重卻明顯低于其他各組(P＜0.05)。血壓Rh組顯著高于其他組(P＜0.01)，Ena組、Val組、Aml組和SO組組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.395)。5組心率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.110)，詳見表2。

表2 5組實(shí)驗(yàn)大鼠生理特征對(duì)比()

表2 5組實(shí)驗(yàn)大鼠生理特征對(duì)比()

注:與 So組比較，①P ＜0.05;與 Rh組比較，②P ＜0.05;與 So組比較，③P ＜0.01

項(xiàng)目 Rh組 Val組 Aml組 Ena組 SO 組9 6體重(g) 291±3① 325±11①② 312±5①② 318±5①② 357±8心率(次/min)427±8 450±9 455±5 450±8 320±7血壓(mm Hg)174±4③ 140±9② 141±6② 137±5②大鼠(只數(shù))877128±3

2.2 各實(shí)驗(yàn)組胸主動(dòng)脈中膜厚度及中膜截面積的對(duì)比:腎性高血壓組(Rh)胸主動(dòng)脈中膜厚度(圖1)及中膜截面積(表3)均較其他各組有顯增性增加(P＜0.01)，其中胸主動(dòng)脈中膜厚度Ena和Am較Val組有輕度減小的趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.227)，即Rh組胸主動(dòng)脈中膜厚度顯著性高于其他各組，而其他各組組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。中膜截面積組顯著高于其他組(P＜0.01)，So組、Ena組、Val組和 Aml組組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.237 ＞0.05)。

圖1 五組大鼠胸主動(dòng)脈組織彈力纖維Orcein染色及蘇木素染色切片

表3 5組實(shí)驗(yàn)大鼠中膜厚度及截面積的對(duì)比()

表3 5組實(shí)驗(yàn)大鼠中膜厚度及截面積的對(duì)比()

注:與 So組比較，①P ＜0.01;與 Rh組比較，②P ＜0.05;與 Rh組比較，③P ＜0.01

組別 例數(shù) 中膜厚度(μm) 中膜截面積(mm2)Rh組 8 141.63 ±4.915① 0.624 ±0.014①Val組 7 123.86 ±4.066② 0.542 ±0.018③Aml組 7 116.09 ±5.852③ 0.507 ±0.025③Ena組 9 115.82 ±5.933③ 0.509 ±0.010③So組 6 109.53 ±5.933③ 0.493 ±0.024③

圖2 胸主動(dòng)脈內(nèi)AngⅡ含量比較

2.3 各實(shí)驗(yàn)組胸主動(dòng)脈內(nèi)ALD、AngⅡ含量的對(duì)比:胸主動(dòng)脈內(nèi)AngⅡ含量，Rh組、Val與Aml兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.207)，且顯著高于 Ena組與 So組(P＜0.05)，Ena組顯著高于So組(P＜0.05)(圖2)。胸主動(dòng)脈內(nèi)ALD含量，Rh、Aml組顯著高于其他三組(P ＜ 0.05)，Ena、Val組組間無差異(P=0.815)，又均顯著高于 So組(P ＜0.05)，見圖 3。

圖3 胸主動(dòng)脈ALD含量比較

2.4 各實(shí)驗(yàn)組胸主動(dòng)脈內(nèi)IMDmRNA及受體mRNA的對(duì)比:圖4(a)顯示實(shí)驗(yàn)大鼠胸主動(dòng)脈中IMDmRNA泳帶，上為標(biāo)準(zhǔn)β－ action 泳帶，自左到右順序依次為 Rh、Aml、Ena、Val、和 So。結(jié)果顯示Rh組較其余組顯著增高(P＜0.05)，其余組兩兩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.539)，見圖4(b)。

圖4 胸主動(dòng)脈IMDmRNA比較

3 討論

2007年ESH/ESC高血壓指南在強(qiáng)調(diào)降壓達(dá)標(biāo)的同時(shí)，還充分強(qiáng)調(diào)了高血壓的診療必須考慮總體心血管危險(xiǎn)，更加強(qiáng)調(diào)識(shí)別靶器官損害和針對(duì)疾病不同階段合理施治的重要性[7]，即高血壓藥物治療不僅是為了緩解或消除癥狀，最終目的是保護(hù)靶器官和改善患者預(yù)后。

高血壓血管重塑與其靶器官損害及預(yù)后密切相關(guān)，血管重構(gòu)發(fā)生相關(guān)的因素包括機(jī)械性因素和體液因素等。體液因素中血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是其中最為重要的。有學(xué)者給大鼠長期注射AngⅡ可促使血管肥厚發(fā)生。結(jié)果提示RAS，尤其是血管壁局部RAS，在血管肥厚發(fā)生中具有重要作用。

中介素(IMD)是運(yùn)用種系發(fā)生圖譜的方法分析基因庫而發(fā)現(xiàn)的一種降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)家族中的多肽，RTPCR，Northern blotting及免疫學(xué)方法測(cè)定出IMD在人和脊椎動(dòng)物的垂體、消化道、腎臟、淋巴組織和胰腺中表達(dá)，在血管、左心室甚至在心房、右心室和血清也有低水平的表達(dá)。IMD具有抑制心肌重塑和強(qiáng)大的擴(kuò)張血管等作用，目前還沒有IMD與血管重塑的報(bào)道。

為研究局部組織中IMD與血管重構(gòu)的關(guān)系及IMD與RAAS的激活有無關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了腎血管性高血壓大鼠模型，并用藥物干預(yù)血壓。結(jié)果顯示，Rh組胸主動(dòng)脈的IMDmRNA較假手術(shù)組顯著升高，利用三種不同降壓藥物在降低血壓相同水平時(shí)IMDmRNA降低的水平相似，然而三種藥物對(duì)胸主動(dòng)脈AngⅡ和ALD水平的影響顯著不同:ALD水平在Rh、Aml組顯著高于其他三組，Ena、Val組又顯著高于So組。AngⅡ水平在Rh組、Val與Aml兩兩比較無差異，且顯著高于Ena組與So組。研究結(jié)果支持此假設(shè):血液動(dòng)力學(xué)負(fù)荷并非RAAS的激活可能是受損靶器官內(nèi)的IMD增加的機(jī)制之一。

筆者的研究表明，Rh組胸主動(dòng)脈血管出現(xiàn)管壁厚度明顯增加，無論是中膜截面積、中膜厚度均顯著高于其他組，同時(shí)Rh組胸主動(dòng)脈中IMDmRNA也顯著高于其他組，應(yīng)用依那普利、左旋氨氯地平和纈沙坦后，胸主動(dòng)脈中膜截面積、中膜厚度均顯著下降，說明IMDmRNA可能參與高血壓血管重塑的調(diào)節(jié)，而三種降壓藥對(duì)高血壓血管重塑的逆轉(zhuǎn)作用無差異，說明IMD對(duì)血管重塑的調(diào)節(jié)作用沒有差異。血管重塑與RAAS、高血壓和IMD三者的相互關(guān)系之中，高血壓與中膜截面積、中膜厚度的變化一致，而IMDmRNA的變化從屬于高血壓的變化，血管重塑與RAAS無直接關(guān)系。

血管重塑實(shí)際是血管壁自分泌或旁分泌的許多復(fù)雜的刺激因子和抑制因子之間相互作用的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)顯示，三種降壓藥從不同機(jī)制降低血壓，并且改善了血管重構(gòu)，效果均沒有顯著性差異，說明血管重構(gòu)的機(jī)制不限于RAAS，擴(kuò)展了血管重塑的機(jī)制，作為自分泌或旁分泌的IMD變化獨(dú)立于RAAS。

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