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      PDGF-A和MVD在大腸癌中的表達(dá)及預(yù)后意義

      2013-11-15 05:50:16駱禮波程家平楊偉明賀新媛楊雪峰蘇曉玥遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院甲狀腺乳腺外科貴州遵義563003遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科貴州遵義563003
      吉林醫(yī)學(xué) 2013年31期
      關(guān)鍵詞:棕黃色大腸癌免疫組化

      駱禮波,程家平,楊偉明,石 磊,賀新媛,楊雪峰,劉 勤,蘇曉玥,任 宇 (.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院甲狀腺乳腺外科,貴州 遵義 563003;.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科,貴州 遵義 563003)

      大腸癌是常見消化道惡性腫瘤,影響患者預(yù)后是腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。早在1971年,F(xiàn)olkman等[1]就提出“腫瘤血管生長因子理論”,他們認(rèn)為:腫瘤生長及轉(zhuǎn)移依賴于新生血管生成。在促進(jìn)腫瘤血管生長諸多因子中,有VEGF家族,F(xiàn)GF家族及PDGF家族等,PDGF家族是研究相對較早因子之一。早在1973年,Ross[2]在人血清中發(fā)現(xiàn)了PDGF,其分子量為27~31 KD,為由A、B兩鏈組成的堿性蛋白質(zhì),因來源血小板而得名。PDGF家族成員包括PDGF-A,PDGF-B,PDGF-C,PDGF-D。多項研究表明,PDGF-A是該家族中研究最多,相對較成熟的腫瘤新生血管誘發(fā)因子。Sharma等[3]指出MVD最有價值的是能預(yù)測實體腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移,并與實體腫瘤各種預(yù)后因素有關(guān),是預(yù)測全身和局部復(fù)發(fā)及無病生存的重要指標(biāo)。Katano等[4]報道:PDGF-A與胃癌關(guān)系密切,可能在胃癌預(yù)后中起重要作用。越來越多研究表明,PDGFA在多種腫瘤中過度表達(dá),與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)[5],參與成纖維細(xì)胞,內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等增殖,具有趨化性和促有絲分裂性能,可以促進(jìn)結(jié)締組織并產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(ECM)及直接或間接導(dǎo)致腫瘤血管生成。閆巍中等[6]研究報道:血管生成素(angiogenin)中的促血管生成素-1(Ang-1),促血管生成素-2(Ang-2)及促血管生成素受體-2(Tie-2)表達(dá)程度與大腸癌的進(jìn)展期呈正相關(guān),而運(yùn)用PDGF-A和MVD對大腸癌患者生存期進(jìn)行評估,國內(nèi)外文獻(xiàn)鮮于報道。本研究運(yùn)用免疫組化方法(Envision法)探討PDGF-A和MVD在大腸癌組織中表達(dá)與患者生存預(yù)后關(guān)系。

      1 資料與方法

      1.1 一般資料:收集我院胃腸外科1997年3月~2007年2月生存期≥5年(甲組)及≤3年(乙組)大腸癌患者組織標(biāo)本各30例。所有標(biāo)本均經(jīng)病理證實為大腸癌組織,全部患者均為第一次手術(shù),術(shù)前均未接受任何放療、化療和其他治療。甲組:男14例,女16例;年齡30~79歲,平均50.1歲。Dukes分期,A+B期18例,C+D期14例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移11例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者19例。乙組:男18例,女12例;年齡27~73歲,平均56.1歲;Dukes分期,A+B期12例,C+D期16例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者14例。60例中,29例未突破肌層,其余31例全部浸潤至漿膜及漿膜層外。分化程度方面,高分化腺癌28例、中低分化腺癌及黏液腺癌32例。

      1.2 免疫組化試劑,儀器及其他耗材:特異性一抗是兔抗人PDGF-A多克隆抗體(編號bs-0196R,工作液濃度1:100),購于北京博奧森公司;鼠抗人CD34單克隆抗體(工作液濃度1:100)購于福州邁新公司。二抗試劑盒(編號GK500705,包括Envision二抗檢測即用型,DAB顯色試劑)購于美國基因公司。經(jīng)多聚賴氨酸處理的防脫玻片,PBS緩沖液,EDTA抗原修復(fù)液及一抗稀釋液均購于北京中杉金橋公司。另二甲苯,乙醇,雙氧水,蘇木素,微波爐均為實驗室自備。

      1.3 實驗方法

      1.3.1 免疫組化染色:石蠟組織切割成4 μm厚切片,均經(jīng)HE染色再次確認(rèn)原始組織學(xué)診斷后行免疫組化染色。二甲苯梯度脫蠟兩次,每次10 min,乙醇梯度水化,3%雙氧水浸泡10 min去除內(nèi)源性過氧化物酶,EDTA微波修復(fù)抗原(CD34,PDGF-A均為10 min),自然冷卻后PBS液沖洗3次,每次5分鐘,加一抗后4℃過夜。第二次給予PBS液沖洗3次,每次5分鐘。滴加二抗,室溫30 min后再次PBS液沖洗3次,每次5分鐘。DAB顯色,蘇木素復(fù)染細(xì)胞核,乙醇梯度脫水,透明,中性樹膠封片。以PDGF-A,CD34強(qiáng)陽性片為陽性對照,磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。

      1.3.2 結(jié)果判定

      1.3.2.1 PDGF-A判斷:PDGF-A主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞漿或胞膜上,在癌旁的間質(zhì)中可見少量表達(dá),以胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性。每張切片選取10個不同部位,400倍視野下計數(shù),按陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例和染色深度進(jìn)行評分和分級。染色強(qiáng)度分級:無著色為0分,淡棕黃色為1分,棕黃色及更深顏色為2分;陽性細(xì)胞分級:陽性細(xì)胞數(shù)≤50%為0分,>50% ~75%為1分,>75%為2分。兩項得分相加,結(jié)果2分為陽性表達(dá)。

      1.3.2.2 MVD判斷:作為標(biāo)記微血管最主要的CD34,以血管內(nèi)皮細(xì)胞胞膜染成棕黃色或棕褐色為陽性表達(dá),MVD計數(shù)參照Maeda等報道方法[7],計數(shù)5個高倍鏡視野(×200)內(nèi)微血管數(shù),取其平均數(shù)為該組織MVD值。以上免疫組化染色結(jié)果均由具備多年病理診斷經(jīng)驗的技術(shù)人員2人采用雙盲法參與判定。

      1.3.3 統(tǒng)計學(xué)處理:實驗結(jié)果采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析。計量資料采用t檢驗,計數(shù)資料采用χ2檢驗,采用Spearman等級相關(guān)進(jìn)行相關(guān)性分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05,P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

      2 結(jié)果

      2.1 PDGF-A,MVD表達(dá)與性別,年齡,分化程度及病理分型關(guān)系:免疫組化顯示:大腸癌組織中PDGF-A主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的胞漿或胞膜內(nèi),以胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒陽性染色為主,而尤其以癌巢邊緣著色明顯,表明PDGF-A表達(dá)最明顯部位位于腫瘤細(xì)胞浸潤前緣,見圖1,腫瘤組織間質(zhì)間可見少量表達(dá)。CD34是目前運(yùn)用最多,較為成熟的標(biāo)記微血管蛋白,以血管內(nèi)皮細(xì)胞胞膜染成棕黃色或棕褐色顆粒為陽性表達(dá)。主要表達(dá)于腫瘤間質(zhì)區(qū),微血管數(shù)量以腫瘤周邊相對較多,見圖 2。60例中,PDGF-A陽性表達(dá)率為53.3%(32/60),MVD值為20~76,平均為41.05。兩者與性別、年齡、TNM分期、浸潤深度無關(guān)。見表1。

      圖1 A大腸癌癌巢胞質(zhì)內(nèi)PDGF-A的表達(dá)(×400)

      表1 大腸癌組織中PDGF-A.MVD的表達(dá)與臨床病理參數(shù)關(guān)系

      圖2 A大腸癌癌巢間質(zhì)內(nèi)CD34的表達(dá)(×100)B大腸癌癌巢邊緣上CD34的表達(dá)(×400)

      2.2 PDGF-A,MVD表達(dá)與病理學(xué)分級,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間關(guān)系:PDGF-A,MVD在腫瘤細(xì)胞病理學(xué)分級的中低分化型,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的表達(dá)分別為65.6%(21/32),70.4%(19/27);(45.72±11.87),(44.37±12.50)均顯著高于高分化型,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的 39.3%(11/28),39.4%(13/33);(35.71±9.37),(38.33±10.65)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

      2.3 PDGF-A,MVD表達(dá)與生存期,患者預(yù)后關(guān)系:生存期≥5年大腸癌患者(甲組)與≤3年大腸癌患者(乙組)PDGFA,MVD表達(dá)分別為36.7%(11/30),70.0%(21/30);(37.70±10.32),(44.40±12.42)。差異較為顯著,有統(tǒng)計學(xué)意義(<0.05)。研究發(fā)現(xiàn),PDGF-A著色及陽性細(xì)胞數(shù)表達(dá)越多切片,相對應(yīng) MVD值越高。兩者呈正相關(guān)(r=0.965,P<0.05)。

      3 討論

      Folkman指出:血管形成可根據(jù)腫瘤發(fā)展分為血管前期和血管期。在血管前期,實體瘤緩慢生長或不生長,多數(shù)直徑不超過1mm,很少向周圍浸潤,幾乎不發(fā)生轉(zhuǎn)移[8]。一旦進(jìn)入血管期,腫瘤必須要建立自身的血管系統(tǒng)以獲得充足的氧和營養(yǎng)成分,生長速度隨之加快,瘤體向周圍侵襲。由于新生腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞不完整或基底膜中斷、缺如、脫落,腫瘤細(xì)胞容易進(jìn)入血液循環(huán),引起腫瘤侵襲,轉(zhuǎn)移。可以說,腫瘤血管的新生在腫瘤良惡性間,惡性腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間扮演了極其重要的角色。多項研究顯示,血管的新生需要多種誘發(fā)因子,如細(xì)胞因子,生長因子,ECM復(fù)合物等[9]。在這些血管生長因子中,PDGF與VEGF,F(xiàn)GF有相似的促血管生成作用。MVD是腫瘤微血管形成程度的標(biāo)志和腫瘤的生物學(xué)特征,是評價腫瘤血管生成狀態(tài)的最佳指標(biāo)。已有多項研究表明,在乳腺癌、腎癌、頭頸部腫瘤等的MVD高低與腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

      PDGF促進(jìn)血管生成的機(jī)制可能為:①腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞都表達(dá)PDGF受體,因此,PDGF在腫瘤表達(dá)上可起自分泌或旁分泌作用。②通過間接途徑即激活鄰近組織細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞釋放VEGF,F(xiàn)GF等生長因子促進(jìn)血管生成。③參與并促進(jìn)惡性腫瘤間質(zhì)反應(yīng),PDGF與其受體結(jié)合可提高ECM降解及促進(jìn)腫瘤侵襲,轉(zhuǎn)移過程。在腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。本試驗表明,生存期≥5年大腸癌患者在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面,其PDGF-A陽性率,MVD數(shù)值與≤3年大腸癌患者比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。PDGF-A對大腸癌的生長和轉(zhuǎn)移可能有促進(jìn)作用,PDGF-A和MVD可以作為判斷大腸癌患者預(yù)后的重要參考指標(biāo)。但其病理學(xué)分級間的顯著差異與辛林等[10]報道PDGF-A與病理學(xué)分級無關(guān),而與Dukes分期呈正相關(guān)不相符合。PDGF-A與病理學(xué)分級相關(guān)原因不清楚,國內(nèi)曾有在口腔鱗狀細(xì)胞癌中PDGF-A與病理學(xué)分級有密切聯(lián)系的報道。關(guān)于在大腸癌中這兩者之間關(guān)系報道甚少,需要深入探討研究。

      [1]Weidner N.Tumor angiogenesis:review of current applications in tumor prognostication[J].Sem in Diag Pathol,1993,10(4):302.

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