HPLC法測(cè)定黃柏提取液中鹽酸小檗堿含量

★ 周敬 于天浩 陳平 董強(qiáng) 梁園 (天津郁美凈集團(tuán)有限公司 天津300110)

中藥藥材黃柏為蕓香科植物黃檗(Phellodendron amrense Rupr，關(guān)黃柏)，及黃皮樹(shù)(Phellodendron chinese Schneid，川黃柏)的干燥樹(shù)皮。黃柏因其具有清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡等功效作為藥材制備中藥或中成藥。很多資料表明，黃柏及其提取物對(duì)治療濕疹、痤瘡等皮科疾病具有良好的效果［1～5］。在化妝品提倡純天然、綠色、環(huán)保的趨勢(shì)下，天津郁美凈集團(tuán)成功地將黃柏提取物添加到化妝品中，使其具備抑菌、抑疹的功效。鹽酸小檗堿是黃柏中最重要的活性成分，故探索以高效液相法(HPLC)測(cè)定黃柏中小檗堿的含量并做系統(tǒng)的方法學(xué)研究論證是天然提取關(guān)鍵技術(shù)的重要環(huán)節(jié)，擬建立快速高效準(zhǔn)確鹽酸小檗堿含量檢測(cè)方法。

1 儀器與試劑

島津LC－10AT高效液相色譜儀，包括LC－10AT雙元泵，SPD－10A紫外檢測(cè)器，CTO－10AS柱溫箱，7725i手動(dòng)進(jìn)樣器(日本島津公司);N－2000雙通道色譜據(jù)工作站(浙江大學(xué)智能信息工程研究所);梅特勒托利多電子分析天平。

鹽酸小檗堿對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所110713－200911，)甲醇、乙腈為色譜純;其它為分析純。水為去離子水;實(shí)驗(yàn)材料為黃柏Phellodendron amrense Rupr，干燥樹(shù)皮。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:GL science Wondasil C18柱(4.6mm×250mm×5μm);流動(dòng)相:乙腈 －0.033mol/L KH2PO4溶液調(diào)pH=3.5(40:60);檢測(cè)波長(zhǎng)345nm;柱溫:40℃;流速:0.8 mL/分;進(jìn)樣量:10μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 稱(chēng)取鹽酸小檗堿對(duì)照品34.9mg于50mL量瓶，加沸水溶解并稀釋至刻度，搖勻，過(guò)0.45μm微孔濾膜待測(cè)。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取黃柏提取液2.0g(精確到0.0001g)于10ml量瓶中，加入少量沸水并用冷水稀釋至刻度，搖勻。取上清液過(guò) 0.45μm微孔濾膜。

2.4 線性關(guān)系的考察 精吸對(duì)照品溶液2.5、5、7.5、10、12.5μL，按2.1 進(jìn)行測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)作圖，得線性良好的直線，方程為:Y=2 ×106X+375618，R=0.9999(n=5)，線性范圍為:1.745μg～8.725μg。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10μL在2.1條件下重復(fù)進(jìn)樣5次，計(jì)算鹽酸小檗堿峰面積RSD=0.21%，表明儀器的精密度良好。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.6 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 精密稱(chēng)取5份同批次黃柏提取液樣品0.5g(精確到0.0001g)，按2.3制備供試液，精密吸取供試液10μL注入高效液相色譜儀，鹽酸小檗堿含量的RSD=1.28%。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取樣品10微升按2.1條件，分別在 0、1、3、6、9、24 小時(shí)進(jìn)樣，鹽酸小檗堿含量的RSD=1.20%，在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 回收率試驗(yàn) 稱(chēng)取與重復(fù)性試驗(yàn)同一批樣品，分別加入80%、100%，120%的鹽酸小檗堿對(duì)照品3份，混勻，精密稱(chēng)取，按2.2條件測(cè)定回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品含量的測(cè)定 精密稱(chēng)取黃柏提取液1.0000g，按2.1條件，按外標(biāo)－峰面積計(jì)算，測(cè)得結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 黃柏提取液中小檗堿含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 利用UV－2401紫外分光光度計(jì)對(duì)照品溶液在200－400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，在250－350 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，并且，因此選擇345 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 流動(dòng)相的選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇－水(0.1%乙酸)，乙腈 －水(0.1%甲酸)，乙腈 －水(0.1%十二烷基硫酸鈉)，乙腈 －水(0.05mol/L NaH2PO4調(diào) pH3.5)，乙 腈 － 水 (0.033mol/L KH2PO4調(diào)pH3.4)，等溶劑系統(tǒng)，以通過(guò)改變的比例，在合適的保留時(shí)間下出峰。整個(gè)分析過(guò)程在20分鐘內(nèi)可完成。因此，最后確定用乙腈 －水(0.033mol/L KH2PO4調(diào)pH3.4)系統(tǒng)作為流動(dòng)相。

4 小結(jié)

通過(guò)方法的方法學(xué)研究及樣品含量實(shí)測(cè)，本文方法具有簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可靠、可重復(fù)的特點(diǎn)，能快捷地檢測(cè)出黃柏提取液中鹽酸小檗堿含量，可用于黃柏提取液在化妝品中的添加量的控制。

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