血管緊張素Ⅱ-2型受體與原發(fā)性高血壓的相關(guān)性研究

王 露，金梅花，徐清斌，馬 萍（.寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏 銀川 750004；.寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科，寧夏 銀川750004）

原發(fā)性高血壓（EH）是由多種環(huán)境因素、生活方式和遺傳因素共同作用所引起的一種多基因遺傳病，遺傳因素所起的作用越來越受到人們的重視，血管緊張素Ⅱ-2型受體（ATR2）基因是RAS系統(tǒng)的重要組成部分[1-2]。國外研究表明：AT2R基因的多態(tài)性與心腦血管疾病存在密切關(guān)系，但關(guān)于寧夏漢族高血壓人群是否存在關(guān)聯(lián)尚未見報道。

1 資料與方法

1.1 一般資料：以寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院心內(nèi)科門診及健康查體中心漢族原發(fā)性高血壓患者及健康查體者（均為長期居住在寧夏自治區(qū)的漢族人）為研究對象。137例原發(fā)性高血壓患者的診斷符合2005年《中國高血壓防治指南》（修訂版）診斷標準，男71例，女66例，平均年齡（45.31±10.51）歲。排除繼發(fā)性高血壓病、過度飲酒、服避孕藥、冠心病、糖尿病、心肌病及肝、腎病史者。149例血壓值正常者（對照組）均為同地區(qū)體檢血壓正常者（收縮壓＜140 mm Hg，舒張壓＜90 mm Hg）（1 mm Hg=0.1333 kPa），男63例，女86例，平均年齡（42.75±11.47）歲。未服用任何降壓藥物，無肝、腎、甲狀腺疾病及糖尿病病史。

1.2 方法

1.2.1 血壓測量：征得所有調(diào)查者口頭知情同意，于清晨采用水銀柱袖帶血壓計測量基礎(chǔ)血壓，囑患者坐位，測量其右上臂血壓值（觀察對象需排空膀胱，每間隔2 min測量1次，共3次，取平均值）。

1.2.2 一般臨床資料的收集：收集患者的性別、年齡、身高、體重、脈率、既往史、吸煙飲酒史、家族史等一般資料，并計算體重指數(shù)。

1.2.3 血液標本的收集：肘靜脈處采集外周抗凝血10 ml，5 ml血清用于空腹血糖（Glu）、肝腎功能和血清總膽固醇（Tc）等生化指標測定，另外5 ml靜脈血EDTA-Na抗凝，-70℃冰箱保存?zhèn)溆茫糜诨蚪MDNA的提取。

1.2.4 基因組DNA的提取和PCR擴增：采用天根生化科技（北京）有限公司血液基因組DNA小量抽提試劑盒提取基因組DNA。引物設(shè)計利用Primer5.0軟件完成，由上海生工生物工程有限公司合成。上游引物序列（P1）：5'-GGA TTC AGA TTT CTC TTT GAA-3'，下游引物序列（P2）：5'-GCA TAG GAG TAT GAT TTA ATC-3'。多聚酶鏈式反應(yīng)（PCR）總體積20μl：其中10×buffer 2μl，dNTP（2.5 mol/L）1.6μl，上下游引物（10μmol/L）各0.4μl，DNA模板1μl，rTaq（5 U/ul）0.1μl，ddH2O 14.5μl；反應(yīng)參數(shù)為94℃預(yù)變性3 min進入循環(huán)，94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，共循環(huán)40次，最后72℃終末延伸10 min。酶切體系10μl包括PCR產(chǎn)物5μl，AluI內(nèi)切酶（10 U/ul） 0.5μl，10×buffer 1.5μl，ddH2O 3μl，37℃水浴過夜；擴增產(chǎn)物經(jīng)含溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠電泳分型后在凝膠成像儀下觀察、保存酶切結(jié)果并鑒定基因型。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理：采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，計數(shù)資料以頻數(shù)表示，組間均數(shù)比較計量資料做t檢驗，研究對象與Hardy-Weinberg平衡的符合程度、基因型頻率與等位基因頻率的比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，二項逐步logistic回歸分析基因型與高血壓病易感性的關(guān)聯(lián)關(guān)系，計算出P值、比值比（odds ratio，OR）及95%的可信區(qū)間（con fi dence index，CI）。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗：EH組和對照組的基因型分布及等位基因頻率分別進行χ2檢驗（EH組：χ2=5.9187，P=0.0519；NT組：χ2=5.9448，P=0.0512），結(jié)果顯示均符合Hardy-Weinberg平衡，表明入選人群符合隨機抽樣、來自同一群體，在遺傳學(xué)上可代表寧夏的漢族人群。

2.2 EH組和NT組一般臨床資料比較：兩組中在年齡、性別、總膽固醇上差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），余各項指標EH組均高于正常對照組人群，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表1。

表1 一般資料比較（ ）

表1 一般資料比較（ ）

注：①兩組之間男、女構(gòu)成比的比較用四格表χ2檢驗P＜0.05

一般資料 EH組（n=137） NT組（n=149） P值年齡（x± ，歲） 45.31±10.51 42.75±11.47 0.051性別（男/女，例）① 71/66 63/86 0.106收縮壓（s x± ，mm Hg） 154.96±15.71 123.43±9.74 0.000舒張壓（s x± ，mm Hg） 94.95±9.51 75.7±7.57 0.000 GLU（s x± ，mmol/L） 5.36±0.1 5.03±0.54 0.001 TG（s x± ，mmol/L） 2.23±1.36 1.75±1.93 0.016 TC（s x± ，mmol/L） 5.81±1.12 5.62±3.33 0.524 HDL-C（s x± ，mmol/L） 3.65±1.11 3.31±0.98 0.007 x± ，mmol/L） 1.21±0.29 1.3±0.27 0.008 LDL-C（ss

2.3 兩組AT2R基因型及等位基因比較：受檢者DNA經(jīng)PCR擴增后，可能會產(chǎn)生321bp、214bp、107bp三個片段，則AT2R的C3123A多態(tài)性的基因型可有純合子CC（僅見321bp）和AA（214bp，107bp），雜合子CA（321bp，214bp，107bp），因AT2R基因位于X-染色體，男性只有半合子，故女性有CC、CA、AA三種基因型，男性僅有CC、AA兩種基因型；以性別分男女亞組，兩亞組中EH及NT組各基因型分布及等位基因頻率相比無顯著差異（P＞0.05）。見圖1與表2。

圖1 AT2R基因C3123A多態(tài)性的基因型

表2 兩組基因型及等位基因分布比較[例（%）]

2.4 不同基因型及等位基因間基本資料比較：女亞組中AC+AA基因型平均動脈壓明顯高于CC基因型組（P=0.037＜0.05），余臨床資料相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；男亞組中不同基因型組間各臨床資料相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.5 AT2R基因C3123A多態(tài)性與高血壓相關(guān)性的二項逐步logistic回歸分析：以是否患有高血壓（0：否，1：是）為應(yīng)變量，將基因型（女亞組：CC、AC+AA型分別為0、1；男亞組：CC、AA型分別為0、1）、年齡、BMI、BUN、血Cr、GLU、UA、TC、TG、HDL-C、LDL-C按男女亞組分別引入模型。采用logistic回歸方法（向前：LR），結(jié)果顯示：女亞組中AC+AA基因型（OR=2.823，P=0.014）及BMI（OR=1.516，P=0.000）、Cr（OR=1.057，P=0.007）、GLU（OR=1.996，P=0.024）增高為EH的危險因素；男亞組中BMI（OR=1.224，P=0.000）增高為EH的危險因素。

3 討論

人類AT2R基因位于X-染色體上約5kb，包含兩個內(nèi)含子、三個外顯子，外顯子3編碼完整蛋白質(zhì)序列，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子位于內(nèi)含子1和啟動區(qū)域[1-2]。AT2R通過拮抗AT1R介導(dǎo)的Ang Ⅱ血管收縮效應(yīng)來舒張血管進而調(diào)節(jié)血管張力[3-4]。

AT2R基因多個位點的多態(tài)性與心腦血管疾病都有關(guān)，Jin等發(fā)現(xiàn)3123A在女性中與高血壓有關(guān)，而在男性中則未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性[3]；而Kang BY等研究卻表明C3123A基因多態(tài)性與EH無顯著相關(guān)[4]；Miyaki K等研究表明A等位基因?qū)τ谌毡局心昴行允雏}攝入對血壓的影響起重要決定作用[5]；Kotani K等表明BMI為日本健康女性C3123A基因多態(tài)性標記[6]。

在本研究人群中，AT2R基因男女亞組中各等位基因頻率及基因型構(gòu)成比均無顯著差異，故C3123A基因多態(tài)性分布與寧夏漢族原發(fā)性高血壓的發(fā)病無顯著相關(guān)；而3123A等位基因頻率男亞組為14.0%，明顯低于Miyaki K（40.1%）及Kang BY（33.66%）的報道[4]；女亞組中3123A等位基因頻率為30.7%略低于Kotani K（33.1%）及Kang BY（32.91%）的報道，其中高血壓患者A等位基因頻率為34.4%，略低于Kang BY（37.8%）；CC、CA、AA基因型頻率高血壓組及正常對照組分別為[5-6]：35.9%、59.4%、4.7%和47.7%、48.8%、3.5%，而Kang BY研究兩組中分別為50.0%、41.2%、8.8%及42.8%、38.8%、18.4%，存在明顯差異；本研究與既往研究存在一定差異，其原因可能為血壓水平受多基因遺傳及環(huán)境因素共同影響，不同種族、人群的遺傳背景差異很大，故樣本來源所致差異不可避免，加之不同實驗疾病選擇、樣本量大小、樣本篩選標準、統(tǒng)計方法選擇等可能存在不同，最終導(dǎo)致不同研究之間存在差異。

經(jīng)二元logistic檢驗發(fā)現(xiàn)女亞組中AC+AA基因型為EH的危險因素，同時女亞組中AC+AA基因型平均動脈壓明顯高于CC基因型組，余臨床資料及男亞組中各等位基因組間臨床資料差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），且男女亞組各基因型及等位基因分布頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），綜上認為AT2R基因C3123A多態(tài)性位點可能不是該地區(qū)漢族人發(fā)生高血壓病的獨立危險因素，也不能確定該等位基因是原發(fā)性高血壓病的致病因子。

[1]Martin MM,Elton TS.The sequence and genetic organization of the human type 2angiotensin Ⅱ receptor[J].Biochem Biophys Res Commun,1995,209(3):554.

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[4]Kang BY,Bae JS,Lee KO.Association Study Between the C3123A Polymorphism of the Angiotensin Ⅱ Type 2 Receptor Gene in the Human X Chromosome and Essential Hypertension in Koreans[J].Environmental Health and Toxicology,2005,25(1):39.

[5]Miyaki K,Hara A,Araki J,et al.C3123A polymorphism of the angiotensin Ⅱ type 2 receptor gene and salt sensitivity in healthy Japanese men[J].Journal of Human Hypertension,2006,20(6):467.

[6]Kotani K,Sakane N,Saiga K,et al.The angiotensin II type 2 receptor gene polymorphism and body mass index in healthy Japanese women[J].Annals of Clinical Biochemistry,2007,44(1):83.