太極拳運動后白細胞Th1/Th2 型細胞因子mRNA 的表達

楊德洪，魏 勇

研究顯示，隨著增齡老年人易出現(xiàn)T 淋巴細胞克隆向Th1 亞群分化［1］，進而出現(xiàn)Th1 型細胞因子分泌增多，抑制Th2 型細胞因子的分泌，即所謂的Thl/Th2極化現(xiàn)象，從而破壞了Thl/Th2 平衡在機體免疫防御反應的調(diào)節(jié)中所具有關(guān)鍵性作用，導致糖尿病、腫瘤和自身免疫性疾病等發(fā)病率增加。大量研究也證實，太極拳運動可以延緩衰老，減少老年性疾病的發(fā)生率，提高生活質(zhì)量［2］，但其確切機制目前尚不清。本研究旨在檢測太極拳運動的不同時段Thl/Th2 型細胞因子mRNA 的表達情況，并進一步了解太極拳運動對Th1/Th2 型細胞因子平衡的影響，探討太極拳健身的可能免疫學機制。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

自愿參加本次測試的中老年女性21 人，年齡在50～65歲之間，均為近期無運動習慣的太極拳運動的初學者。臨床醫(yī)學檢查均排除高血壓、冠心病、腫瘤、神經(jīng)、精神類疾病及其他慢性消耗性疾病和影響HSP70 表達的有關(guān)因素。研究對象的基本情況見表1。

表1 研究對象基本情況(Mean±SD)

1.2 研究方法

1.2.1 訓練計劃

1)運動項目:以學練國際推廣套路48 式太極拳為項目內(nèi)容。

2)運動強度:采用遙測心率儀對運動強度進行監(jiān)控。每月調(diào)整一次強度，通過改變練習時重心高度、練習間歇時間調(diào)節(jié)運動強度，使強度位于靶心率之間。靶心率計算公式:靶心率=60%～80% ×(220－年齡)

3)運動時間和頻率:每次練習持續(xù)1～1.5 小時，每周練習3 次(隔天一次)，實驗周期共6 個月(2004年10月～2005年3月)。

整個太極拳學習和訓練過程由專人進行指導。

1.2.2 取材

分別于實驗前、運動后第3 個月、第6 個月的晨7:30－8:00 對各受試者進行樣品采集。抽肘靜脈血2 ml 全血注入肝素(10 U/ml)抗凝試管，然后立即離心(1 500 rpm，10 min)。以紅細胞裂解液溶解全血中的紅細胞后，轉(zhuǎn)至1.5 ml eppendorf 管中，制備成白細胞沉淀保存于－80℃冰箱備用。

1.2.3 細胞因子mRNA 檢測

1.2.3.1 抽提RNA 合成cDNA 使用經(jīng)典法RNA 抽提試劑盒從白細胞沉淀中抽提總RNA (試劑盒由上海申能博采生物科技有限公司提供)。按照RevertAidTM 第一鏈cDNA 合成試劑盒把2 μg RNA 用作模板合成cDNA(試劑盒購自立陶宛MBI Fermentas 公司)。在0.2 ml effendorf 管中進行反轉(zhuǎn)錄，反應總體積20 μl。合成的cDNA 儲存在－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 實時定量PCR 檢測 根據(jù)Genbank 數(shù)據(jù)庫中公開發(fā)表的基因序列，設計INF－γ、IL－2、IL－4、IL－10 和GAPDH 的引物和探針，見表2。各探針在兩端分別具有報告基團6－羧基熒光素(6－carboxyfluorescein，6－FAM)(位于5＇端)，和淬滅基團6－羧基－四甲基羅丹明(6－ carboxy－ tetramethyl－ rhodamine，TAMRA)(位于3＇端)。

表2 INF－γ、IL－2、IL－4、GAPDH 的引物和探針

定量PCR 檢測在Rotor－Gene RG 3000 (Corbett，Australia)熒光PCR 儀上進行。定量PCR 反應液包含:10 × PCR 反應緩沖液2.5 μl，25 mM MgCl21.5 μl，上游及下游引物(400μM)各0.1 μl，0.1μl 熒光素標記探針(50 μM)，10 mM dNTP 0.5 μl，0.5μl Taq DNA 酶(1.25 units)，2 μl cDNA，DEPC－H20 17.7 μl。上述反應液可保存于－20℃。定量PCR 反應條件:50℃預熱300 s;95℃變性300 s;95℃20 s，60℃60 s，40 個循環(huán)，每個循環(huán)在60℃時檢測熒光強度。根據(jù)標準曲線計算每個基因的拷貝數(shù)。

1.2.4 統(tǒng)計學處理

所有實驗測試指標均表示為Mean± SD，采用SPSS11.0 統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進行處理。顯著性標準以P ＜0.05 為有顯著性差異，P ＜0.01 為有非常顯著性差異。

2 實驗結(jié)果

2.1 6 個月太極拳運動干預后外周血白細胞INF－γ mRNA、IL－4 mRNA 的變化

經(jīng)過太極拳運動干預，中老年婦女外周血白細胞INF－γ mRNA 的表達量逐漸降低，3、6月時表達量均與干預前相比存在明顯差異。IL－4 mRNA 表達量先降低后回升，但仍未達初始水平，且3月時的表達量與干預前相比存在顯著性差異(表3)。

表3 白細胞INF－γ mRNA、IL－4 mRNA的變化(Mean±SD，n=21)

2.2 6 個月太極拳運動干預后外周血白細胞INF－γ mRNA/IL－4 mRNA 的變化

經(jīng)過太極拳運動干預，中老年婦女外周血白細胞INF－γ mRNA 與IL－4 mRNA 比值逐漸降低，與干預6月相比干預前和干預3月均存在明顯差異(如表4)。

表4 白細胞INF－γ mRNA 與IL－4 mRNA 比值的變化

3 分析與討論

Thl/Th2 細胞的調(diào)節(jié)對維持機體正常的免疫功能至關(guān)重要［3］。在生理條件下，機體Th1/Th2 細胞的免疫功能處于動態(tài)平衡狀態(tài)，一旦這種平衡發(fā)生偏離，機體就會趨向疾病狀態(tài)。當Th1 細胞占優(yōu)勢時，機體可產(chǎn)生細胞免疫亢進相關(guān)性疾病，當Th2 細胞占優(yōu)勢時，機體可發(fā)生體液免疫亢進相關(guān)性疾病。Th1 和Th2 細胞因子所誘導的免疫反應又可相互調(diào)節(jié)或交叉調(diào)節(jié)［4］。因此，Thl/Th2 的失衡與自身免疫病、過敏性疾病、腫瘤、移植排斥反應以及感染性疾病的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系。一般Thl 細胞可分泌IFN－γ 而不分泌IL－4，Th2 細胞可分泌IL－4 而不分泌IFN－γ，通常以這兩種細胞因子作為鑒別Thl、Th2 的標志。

3.1 衰老與Th1/Th2 型細胞因子表達

以往檢測細胞因子多通過培養(yǎng)和絲裂原刺激方式，從蛋白水平觀察細胞因子，顯示的是細胞對刺激的反應能力而未必能完全反映機體當時細胞因子的表達狀況。如欲客觀反映機體免疫調(diào)節(jié)和機能狀況，尚需在無任何刺激的狀態(tài)下檢測自發(fā)性細胞因子mRNA的基因表達水平。

熒光實時定量PCR 的問世為檢測細胞中微量自發(fā)性Th1/Th2 特征性細胞因子mRNA 的表達提供了技術(shù)保障。根據(jù)Taqman 技術(shù)對靶基因mRNA 表達進行定量分析是近年來發(fā)展起來的一項新技術(shù)［5］，其原理是將靶基因特異性的一組引物和熒光標記探針與模板cDNA 進行雜交，然后在多聚酶鏈反應過程中利用Taq 酶的3’－核酸外切酶活性水解探針3’段的熒光淬滅基團，獲得熒光激發(fā)信號，后者與模板量呈正相關(guān)。通常將這種熒光實時定量PCR 分為相對定量和絕對定量兩類。相對定量分析以靶基因陽性表達的細胞作為標準，通過分析靶基因與內(nèi)參照基因(如GAPDH 等)的比值，獲得待測樣本中靶基因表達的相對值。這種方法的優(yōu)點是容易開發(fā)，但所得的數(shù)值受陽性標準細胞的影響，不同的實驗室若采用不同的陽性細胞作為標準，則結(jié)果難以相互比較。絕對定量是采用拷貝數(shù)已知的DNA 片斷作為標準，該片斷可采用基因克隆或PCR 擴增獲得。由于絕對定量檢測是以一種可以標準化的DNA 參照物作為基準，因而不同實驗室的檢測結(jié)果具有可比性。絕對定量PCR 檢測技術(shù)是定量PCR 的發(fā)展方向。

本研究采用陳佩杰教授自主研發(fā)的實時定量PCR 細胞因子檢測專利技術(shù)［6］，對健康中老年婦女外周血白細胞的自發(fā)性Th1/Th2 細胞因子的基因表達進行了實時定量的觀測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)健康中老年婦女確實存在自發(fā)性細胞因子的基因表達，進一步證實該項技術(shù)能夠評價生理狀態(tài)下免疫細胞的細胞因子表達。

研究顯示，隨增齡細胞因子網(wǎng)絡發(fā)生了復雜的變化，一些細胞因子生成減少(如IL－2)，而另一些細胞因子產(chǎn)生增多(如IL－1、IL－6 和TNF－α)，其中主要是Thl 型細胞因子向Th2 型細胞因子的轉(zhuǎn)化［7］和炎癥性細胞因子產(chǎn)生增多。但是Sakata 等研究發(fā)現(xiàn)老年人外周血CD4 +T 細胞產(chǎn)生IFN－γ 的水平高于年輕組，而IL－4 水平降低，提示老年個體有Thl 的極化現(xiàn)象［1］。對于健康中老年人而言，由于衰老而出現(xiàn)的Th1/Th2 極化方向目前尚沒有定論。本研究結(jié)果顯示，健康中老年婦女在未接受任何干預時外周血白細胞IFN－γmRNA 和IL－4 mRNA 的比值為0.5589±0.012。由于目前沒有公認的健康人群Th1/Th2 細胞因子平衡的標準，本研究也沒有涉及不同年齡組之間的比較，因此，僅憑此結(jié)果還不能判斷本研究的中老年婦女是否存在Th1/Th2 極化現(xiàn)象以及極化方向。

3.2 太極拳運動對Th1/Th2 平衡的影響

運動對Th1/Th2 淋巴細胞因子影響的研究很少。Moyna 等［8］研究了平時經(jīng)?；顒雍突顒雍苌俚哪行院团栽谶f增負荷運動后血清Th1/Th2 代表性細胞因子的變化，結(jié)果證實運動能夠改變Th1/Th2 平衡。

Suzuki K 等［9］研究發(fā)現(xiàn)，力竭運動可以導致Th1/Th2 平衡向Th2 偏移。與此不同的是，Lancaster GI等［10］的研究發(fā)現(xiàn)運動后即刻和恢復期Th1 型淋巴細胞在循環(huán)中的百分比和數(shù)目以及其代表性細胞因子IFN－γ 均明顯下降，但Th2 淋巴細胞及其代表性細胞因子IL－4 卻沒有明顯變化。Steensberg A［11］等的研究也發(fā)現(xiàn)運動后即刻和2 小時循環(huán)血中的Th1 細胞比例被抑制，而Th2 細胞比例沒有變化。Kohut ML［12］等卻發(fā)現(xiàn)運動可以增加Th1 相關(guān)細胞因子IL－1 和IFN－γ，而對Th2 相關(guān)細胞因子IL－10 沒有影響。分析這些不一致的研究結(jié)果，可能與各研究的研究對象、運動強度、運動持續(xù)時間等有關(guān)。

本研究顯示太極拳運動后中老年婦女外周血白細胞INF－γ mRNA 的表達量逐漸降低，3、6月時表達量均與干預前相比存在明顯差異。IL－4 mRNA 表達量先降低后回升，但仍未達初始水平，且3月時的表達量與干預前相比存在顯著性差異。而INF－γ mRNA 與IL－4 mRNA 比值逐漸降低，與干預6月相比干預前和干預3月均存在明顯差異?？紤]到本研究的實驗對象為太極拳初學者，前3 個月的太極拳鍛煉對機體的應激不大，所以從第6月和運動前相比，其結(jié)果更能反映太極拳運動的影響。因此，本研究的結(jié)果可以簡化為INF－γ mRNA 下降明顯，IL－4 mRNA 沒有明顯變化，INF－γ mRNA 與IL－4 mRNA 比值下降明顯，提示太極拳運動使中老年婦女Th1/Th2 向Th2 極化，這一結(jié)果與文獻［9－11］相似。

運動影響Th1/Th2 平衡的機理還不明確。Elenkov IJ［13－14］通過分析文獻認為，運動所致的糖皮質(zhì)激素和兒茶酚胺等應激激素可能會選擇性地抑制Th1 細胞免疫軸，使得機體免疫機能向Th2 介導的體液免疫偏移。太極拳影響Th1/Th2 細胞因子的機理可能也與運動后激素分泌以及與免疫系統(tǒng)的相互作用有關(guān)，但確切機制還有待進一步驗證。

3.3 中老年婦女太極拳運動后Th1/Th2 變化的可能意義

研究顯示，隨著增齡，老年人易出現(xiàn)T 淋巴細胞克隆向Th1 亞群分化［1］，進而出現(xiàn)Th1 型細胞因子分泌增多，抑制Th2 型細胞因子的分泌，即所謂的Thl/Th2 極化現(xiàn)象，從而破壞了Thl/Th2 平衡在機體免疫防御反應的調(diào)節(jié)中所具有關(guān)鍵性作用，導致糖尿病、腫瘤和自身免疫性疾病等發(fā)病率增加。

從細胞整體水平而言，細胞因子譜有Thl 或Th2型細胞因子占優(yōu)勢的格局，這提示特定的細胞因子在特定的體內(nèi)環(huán)境下會發(fā)生相對優(yōu)勢轉(zhuǎn)化，正是這種轉(zhuǎn)化滿足了機體對不同抗原刺激應答的實際需要［15］。如果能人為地選擇性誘導或調(diào)控Th1/Th2 細胞的免疫反應，促使Th1/Th2 細胞反應的動態(tài)平衡，則將十分有利于疾病轉(zhuǎn)歸。這應該是應用各種方法調(diào)整衰老機體體內(nèi)Thl/Th2 平衡以延緩衰老，減少老年相關(guān)疾病發(fā)病率的理論基礎(chǔ)。鄧陽勇等［16］的研究證實了這一方法的可行性。他們通過蘆薈多糖調(diào)節(jié)衰老模型小鼠Th1/Th2 細胞因子失衡，使其偏移逆轉(zhuǎn)，則減少了老年性疾病的發(fā)生，延緩了衰老。

大量研究也證實，太極拳可以延緩衰老，減少老年性疾病的發(fā)生率，提高生活質(zhì)量，但其確切機制目前尚不清。本研究結(jié)果顯示經(jīng)過太極拳運動干預后INF－γ mRNA 下降明顯，IL－4 mRNA 沒有明顯變化，INFγ mRNA 與IL－4 mRNA 比值下降明顯，提示太極拳運動使中老年婦女Th1/Th2 向Th2 極化。Sakata－Kaneko S［1］的研究證實，衰老使老年人Th1 型細胞因子分泌增多，抑制Th2 型細胞因子的分泌，即所謂的Thl/Th2 向Thl 極化現(xiàn)象。結(jié)合這一結(jié)果，作者認為太極拳運動使衰老個體Thl 極化的細胞因子分泌逆轉(zhuǎn)，從而使衰老機體Th1/Th2 細胞反應重新回歸動態(tài)平衡。進一步提示，太極拳運動調(diào)節(jié)機體的Thl/Th2 型細胞因子的平衡也許是太極拳調(diào)節(jié)中老年機體免疫力，增強健身效果的可能機制，但這還有待實驗研究予以驗證。

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