白蓮腐敗病病原菌的分離鑒定

胡長志 ，孫曉棠 ，謝克強(qiáng) ，蔣軍喜 ，鄭興汶 ，崔汝強(qiáng)

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南昌，330045；2.江西廣昌白蓮產(chǎn)業(yè)發(fā)展局）

白蓮（Nelumbo nuciferaGaertn）是一種水生經(jīng)濟(jì)作物，在我國分布很廣，南北都有種植。改革開放后，特別是近些年來，我國子蓮產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全國子蓮種植面積10萬hm2以上，是我國種植面積最大的水生作物之一。蓮腐敗病是蓮種植區(qū)發(fā)生最普遍、為害嚴(yán)重的病害之一，在生長期和蓮藕貯藏期均可發(fā)病，分布廣闊，全國各蓮區(qū)均有發(fā)生[1]。蓮腐敗病屬土傳病害，病菌往往造成藕鞭、藕節(jié)、藕根腐爛，同時(shí)地上部分的葉、花也會萎蔫黃枯，發(fā)病嚴(yán)重的整株枯死[2]。

江西白蓮主產(chǎn)區(qū)每年有30%～70%的蓮發(fā)生蓮腐敗病，10%～15%的嚴(yán)重發(fā)生蓮腐敗病，顆粒無收，蓮農(nóng)損失慘重。目前對該病害的致病機(jī)理、病害發(fā)生流行規(guī)律及有效的防治措施等鮮有報(bào)道，為病害的防治帶來了較大的困難。蓮腐敗病已成為阻礙白蓮產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展的一大障礙。本試驗(yàn)以廣昌發(fā)病白蓮為材料結(jié)合傳統(tǒng)的植物病原鑒定方法和分子生物學(xué)技術(shù)對該病害的病原菌進(jìn)行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 病菌的分離鑒定

2011年7月從江西省廣昌縣采集具有典型白蓮腐敗病癥狀的病株，參照劉國安[2]的方法取病株蓮鞭、節(jié)和須根進(jìn)行病菌分離，在馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSA）平板上28℃明暗12 h交替培養(yǎng)；待菌落生長后取先端菌絲進(jìn)一步純化。觀察菌落形態(tài)、分生孢子產(chǎn)生及其形態(tài)和大小。

1.2 致病性測定

將純化的病菌于PSB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)制成10-6的孢子菌懸液針刺接種到蓮籽育出2 a生健康的蓮藕和蓮鞭上，蓮藕保濕24 h后栽回滅菌土中，蓮鞭于28℃光照培養(yǎng)箱中保濕；以無菌水為對照接種[2，3]。

1.3 DNA的提取

將分離的經(jīng)致病性測定的病原菌采用PSA液體培養(yǎng)基在28℃120 r/min培養(yǎng)48 h后過濾收集菌絲，將菌絲轉(zhuǎn)移至滅菌的研缽中，用液氮將菌絲迅速研磨成粉末。采用CTAB法提取總DNA[4]。

1.4 ITS區(qū)段擴(kuò)增分析

圖1 病原菌的致病性測定及形態(tài)光學(xué)照片

利用ITS通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）/ITS 4 （5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'），以總 DNA為模板，進(jìn)行擴(kuò)增[4]。PCR 反應(yīng)體系為：10×PCR Buffer2.5μL，10mmol/LeachdNTP0.5μL，ITS1（10 pmol）0.5 μL，ITS4（10 pmol）0.5μL，ddH2O 補(bǔ)足 25 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 3 min；94℃ 30 s，54℃ 35 s，72℃1 min，30 個循環(huán)；72℃ 5 min；16℃保存。

取 PCR產(chǎn)物各 8 μL，0.6%瓊脂糖凝膠加5%Goldview染液，TAE緩沖液，100 V穩(wěn)壓電泳50 min，用凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果[5]。根據(jù)DL2000 Marker標(biāo)準(zhǔn)核酸中對應(yīng)條帶位置推斷提取出的DNA分子量大小范圍。將回收的PCR產(chǎn)物連接至pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)，利用菌落PCR篩選陽性克隆，送至上海英濰捷基貿(mào)易有限公司測序。

1.5 同源性比對及系統(tǒng)發(fā)育分析

測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行BLAST比對，確定與試驗(yàn)菌株親緣關(guān)系最近的種屬。從GenBank數(shù)據(jù)庫獲得相關(guān)種屬的ITS區(qū)序列，利用MEGA 4.0軟件[6]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，確定分離菌株的分類地位。序列對排用CLUSTAL X1.83 program[7]，進(jìn)化樹的構(gòu)建用Neighbour-joining方法。進(jìn)化樹分支模式的穩(wěn)定性用SEQBOOT和CONSENSE program進(jìn)行bootstrap分析，重復(fù)次數(shù)為1 000，計(jì)算各分支的置信度[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的形態(tài)鑒定

對引起廣昌白蓮腐敗病的病原物進(jìn)行分離，并進(jìn)行形態(tài)鑒定。病原物在PSA培養(yǎng)基上氣生菌絲早期為白色隨后變成深紫色，經(jīng)明暗交替培養(yǎng)20 d后產(chǎn)生大小兩種孢子。大型分生孢子鐮刀形，無色，稍彎曲，兩端尖細(xì)，大小為（39.1～55.2）μm×（2.8～4.6）μm，多為 3個隔膜，少部分為 1～2隔或 4～5隔；小型分生孢子橢圓形，無色，無隔膜，大小為（5.0～9.2）μm×（2.0～3.5）μm；厚垣孢子球形，頂生或間生，單胞，直徑4.5～11.5 μm。初步鑒定為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。

2.2 致病性測定結(jié)果

蓮鞭接種4 d后針眼處便有菌絲生長，10 d后將蓮鞭沿針眼處縱截面切開，可見接種點(diǎn)變褐腐爛（圖1A）；對照不發(fā)病。蓮藕接種后自然條件下60 d后可見典型病狀（圖1B）。

2.3 ITS區(qū)PCR擴(kuò)增

采用通用引物ITS 1和ITS 4對其中致病性較強(qiáng)的 6 個菌株（F11-1、F11-2、F22-1、F32A、F23C和F23D）的ITS區(qū) rDNA進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測并與標(biāo)準(zhǔn)分子量比較，結(jié)果顯示，均出現(xiàn)一條長度約為500 bp的擴(kuò)增條帶（圖2），條帶特異性好。

2.4 ITS區(qū)域同源性比對

采用通用引物對6個菌株的ITS區(qū)rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序獲得500 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。將獲得的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已報(bào)道的序列進(jìn)行Blast分析，6個菌株與已知尖孢鐮刀菌蓮?；?（臺灣）Fusarium oxysporumf.sp.nelumbicola，F(xiàn).oxysporumf.sp.rapae和F.oxysporumf.sp.raphani的同源性最高為98.7%～99.3%。6個菌株之間ITS序列同源性為99%以上。

2.5 系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

將6個菌株的ITS區(qū)序列與同源性較高的相關(guān)種的ITS區(qū)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），結(jié)果表明，從蓮上分離的6個菌株與尖孢鐮刀菌蓮?；停―Q002550）及尖孢鐮刀菌其他?；途墼谝黄饦?gòu)成一個分支，支持度為95%，進(jìn)一步證明廣昌白蓮腐敗病病原菌為尖鐮孢菌蓮?；?。

3 結(jié)論與討論

尖孢鐮刀菌形態(tài)鑒定的重要特征是大孢子的形狀、大小以及隔膜的個數(shù)，而大孢子的產(chǎn)生需要一定的培養(yǎng)時(shí)間和相應(yīng)的誘導(dǎo)條件，這為形態(tài)鑒定帶來了一定的困難。我們也一直在摸索便利的分子檢測鑒定的方法，rDNA ITS區(qū)受到的選擇壓力較小，進(jìn)化速率較快。在絕大多數(shù)真核生物中表現(xiàn)出極為廣泛的序列多態(tài)性，已成為一種探求科內(nèi)、屬內(nèi)、種間的系統(tǒng)親緣關(guān)系及其物種鑒別的重要分子標(biāo)記。利用這個片段開展的BLAST比對發(fā)現(xiàn)，NCBI上登錄了大量尖孢鐮刀菌的相應(yīng)序列，長度500 bp左右，涵蓋了多個寄主專化型。這些信息對于利用該片段開展系統(tǒng)發(fā)育分析提供了便利[9]。該分子標(biāo)記技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、微量、靈敏度高、程序簡單等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于真菌的分類鑒定、檢測和病害診斷[10]。本研究結(jié)果為下一步蓮腐敗病檢測和防治工作的開展打下了基礎(chǔ)。

圖2 6個菌株ITS rDNA的PCR電泳擴(kuò)增條帶

圖3 6個菌株ITS區(qū)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

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