全氟戊烷微滴乳劑增強HIFU療效的研究

朱媚莉，張愛麗，向昱，白景峰，F(xiàn)abiilli Mario，F(xiàn)owlkes Brian

1 上海交通大學生物醫(yī)學工程學院，上海市，200030

2 上海交通大學Med-X研究院，上海市，200030

3 Department of Radiology,University of Michigan Health System,ann arbor,MI,USA

0 引言

高強度聚焦超聲(high intensity focused ultrasound,HIFU)作為一種無創(chuàng)治療腫瘤的技術(shù)，已廣泛應用于腫瘤的臨床治療中[1-2]。在臨床治療中發(fā)現(xiàn)，對于體積較大的腫瘤，HIFU治療所需時間較長，有些甚至需長達幾個小時[3]，患者在長時間的治療過程中難以保持不移動，這就增加了HIFU治療的風險[4]。有研究表明，造影劑微泡的存在可降低HIFU空化效應的閾值，對于HIFU損傷有一定的加強作用，能在短時間內(nèi)能形成更大的損傷病灶[5]。但由于造影劑本身在體內(nèi)循環(huán)時間短，需多次灌注才能在治療時提供充足的微泡，而它的大量灌注可能會導致毛細血管出血，存在安全隱患[6]。

全氟戊烷微滴乳劑，在常溫下用蛋白質(zhì)或脂質(zhì)包裹，它會以液態(tài)形式存在，在體內(nèi)可較長時間穩(wěn)定循環(huán)，在一定頻率和強度的超聲作用下，可被激發(fā)成微氣泡[7]，從而增強對超聲波的吸收，增加熱效應[8]。液態(tài)的全氟戊烷微滴乳劑，比氣態(tài)的微泡更為穩(wěn)定，可減少注射后微滴或微泡由于血液循環(huán)等造成的損失；此外，僅在聚焦超聲焦域內(nèi)的微滴才轉(zhuǎn)化為微泡，可避免微泡對焦域外血管的損傷；焦域內(nèi)微滴在超聲作用下迅速轉(zhuǎn)換為直徑增大數(shù)倍的微泡時也會造成焦域內(nèi)血管的阻塞，減少血流帶走熱量。為將該微滴用于臨床治療，必須先進行在體動物的實驗研究。而目前已有研究采用的HIFU系統(tǒng)均為大型設(shè)備，不便于對小動物模型進行在體研究，其定位及操作控制等方面都存在著一定的局限性。上海市Med-X研究院教育部數(shù)字醫(yī)學工程中心研制的小型高強度聚焦超聲（HIFU）系統(tǒng)，因其聚焦超聲換能器組成的探頭小，操作方便，適用于本文的小動物的試驗研究。同時結(jié)合制備的全氟戊烷微滴乳劑，對它的相變在體轉(zhuǎn)化與增強HIFU治療的熱效應之間的關(guān)系進行研究，探索該協(xié)同治療方法的可行性。

1 材料與方法

實驗所用的相變?nèi)焱槲⒌稳閯ū疚囊韵潞喎Q微滴乳劑）制備與文獻[9]所用方法相同。圖1所示為稀釋1000倍后的該微滴乳劑在400倍顯微鏡下的照片，可見微滴形態(tài)良好、穩(wěn)定。實驗前采用庫爾特粒度儀(Multisizer 3，Beckman Coulter,Inc)對稀釋一萬倍后的微滴乳劑數(shù)目隨微滴直徑的分布進行測量，測量結(jié)果如圖 2所示，所測微滴乳劑的平均粒徑為1.037 μm，其中99%的粒徑小于3 μm。

圖1 顯微鏡下全氟戊烷微滴乳劑照片F(xiàn)ig.1 Microscopic image of droplets

圖2 稀釋104倍后全氟戊烷微滴乳劑的數(shù)目隨微滴直徑分布曲線Fig.2 Droplets number distribution with size after being diluted to 104 times

實驗所用的仿生物組織的膠體采用雞蛋清、聚丙烯酰胺等按照文獻[8]中方法制備。實驗組膠溶液在凝結(jié)之前加入相應劑量的微滴乳劑，并用攪拌子緩慢攪拌，使微滴均勻分散于膠體中。加入致凝試劑并攪拌之后，倒入直徑為4.5 cm、高為5 cm的圓柱形模具之內(nèi)，置入4oC冰箱內(nèi)使其凝結(jié)，次日取出進行實驗。

實驗采用的小型HIFU系統(tǒng)由17陣元組成，通過自帶高精度定時功能的HIFU相位信號發(fā)生器可產(chǎn)生連續(xù)波或脈沖波治療模式[10]。HIFU系統(tǒng)發(fā)射的超聲波頻率為2 MHz，聲強可調(diào)節(jié)。探頭浸沒于4.8 cm直徑的水槽中，實驗設(shè)置的焦點距水槽底部5 cm。水槽高度為4 cm，表面覆蓋一層導聲性能良好的圓形高分子薄膜，通過帶螺紋的1 cm高左右的環(huán)形水槽蓋旋緊的方式將薄膜固定，并將水槽密封。實驗時，直徑為螺紋蓋內(nèi)徑尺寸的膠體可直接置于封膜上方，封膜表面加入一定的去氣去離子水，使封膜與膠體形成良好的耦合，如圖3所示。

圖3 小型HIFU 系統(tǒng)探頭及膠體實驗示意圖Fig.3 The transducer of the small HIFU system and setup of the phantom

實驗所用動物為8周鼠齡的健康裸鼠，中科院上海動物實驗中心提供，飼養(yǎng)于人工12 h晝夜交替控制，且溫度和濕度適宜的動物房內(nèi)經(jīng)過消毒的獨立鼠籠中，并提供充足的60鈷輻射滅菌飼料及高溫滅菌水。

2 實驗結(jié)果及討論

將實驗制備的仿生物組織的膠體分為三組，分別為不含微滴乳劑，含有濃度為1.2×105U/mL以及1.2×106U/mL的微滴乳劑的膠體。實驗前三組膠體通過肉眼及B超觀察，膠體內(nèi)蛋白均勻分布，透明度較高，一致性良好。

三組膠體均采用相同的HIFU參數(shù)，最大聲強為1900 W、連續(xù)波持續(xù)時間為30 s進行輻照。輻照后，對膠體進行B超成像，并用相機拍照。從與HIFU入射方向相同角度拍攝膠體橫切面內(nèi)蛋白凝固變性形成的損傷，依次為不加微滴乳劑、加入微滴乳劑濃度為1.2×105U/mL以及1.2×106U/mL濃度的膠體圖像，如圖4所示。

圖4 相同連續(xù)波模式下HIFU輻照對添加不同濃度全氟戊烷微滴乳劑膠體橫向切面損傷情況Fig.4 Optical images of gel in horizontal plane with different concentration of droplets after HIFU exposure of the same continuous wave

膠體內(nèi)蛋白經(jīng)輻照發(fā)生凝固的區(qū)域變成白色不透明，肉眼易分辨。從圖4中明顯可見，凝固性壞死的區(qū)域隨著微滴乳劑的濃度增大而增強。結(jié)合圖5可看出，加入微滴乳劑濃度為1.2×105U/mL時圖4(b)，HIFU形成的凝固性損傷的區(qū)域明顯大于不加入微滴乳劑的損傷圖4(a)。膠體損傷從垂直入射方向用相機拍攝及B超成像的縱切面結(jié)果分別如圖5(a)、5(b)所示，從圖5(b)可所見，不添加微滴乳劑時蛋白凝固區(qū)域分成焦區(qū)及焦前區(qū)封膜與膠體接觸面兩部分，焦區(qū)損傷形狀較規(guī)則，而焦前區(qū)損傷表明膠-水-封膜界面存在熱量累積；添加低濃度（1.2×105U/mL）微滴乳劑的膠體，由于焦前區(qū)域的熱量積累使該區(qū)域的微滴轉(zhuǎn)化為氣泡，從而加重了焦前區(qū)的損傷程度，膠體從與封膜接觸面到焦點區(qū)域形成大量凝固性壞死，證明該濃度下微滴乳劑對HIFU熱效應的加強效果顯著；而當加入微滴乳劑的濃度為1.2×106U/mL時，熱量更多集中在焦前區(qū)域，由于微滴濃度過高，超聲從探頭穿過封膜進入膠體時存在較強的反射，使膠前區(qū)微滴大量轉(zhuǎn)化為氣泡，導致聲波能量傳輸受到嚴重阻礙，無法再聚集于預期的焦點位置，膠體與HIFU探頭封膜接觸面反而形成嚴重損傷。見圖4(c)。

圖5 相同連續(xù)波模式下HIFU輻照對膠體損傷縱向切面圖像Fig.5 In the axial-elevational plane with different concentration after HIFU exposure of the same continuous wave

以上的實驗結(jié)果證明，適宜濃度的微滴乳劑能加強HIFU的熱效應，但當微滴乳劑濃度過高時，則會對焦點處熱量的積累形成反作用。此外，小型HIFU系統(tǒng)采用封膜包裹探頭內(nèi)的去氣去離子水，雖易于操作，但會使膠體-水-封膜界面形成較強的超聲反射，不利于超聲的傳輸以及聚焦，尋找導聲性能更好的高分子薄膜是進一步要研究的工作。

為了進一步研究小型HIFU系統(tǒng)在體內(nèi)血管內(nèi)相變的全氟戊烷微滴乳劑激發(fā)情況，將裸鼠采用腹腔注射100 μL的戊巴比妥鈉（1.6%）麻醉后，尾靜脈注射100 μL即時稀釋到濃度為1.2×107U/mL的微滴乳劑。約30 s后，從背部拉出一塊皮膚采用耦合膠耦合至HIFU探頭水槽封膜上方焦點處固定，并作好標記。啟動小型HIFU系統(tǒng)，發(fā)射30 s連續(xù)波作用于拉出的皮膚上。1 min后，腹腔注射300 μL戊巴比妥鈉（1.6%）使裸鼠安樂死，隨機剪取輻照后的幾處皮膚，剪成小片置于玻片上，采用正置熒光顯微鏡觀察并拍攝圖像。小型HIFU系統(tǒng)激發(fā)微滴乳劑后產(chǎn)生的微泡如圖6所示，放大倍數(shù)為100。微泡最大直徑約為58 μm左右，是原先微滴粒徑的數(shù)倍，形狀較規(guī)則。

圖6 顯微鏡下裸鼠血管內(nèi)小型HIFU系統(tǒng)激發(fā)產(chǎn)生的微泡Fig.6 Microscopic image of bubbles vaporized by small HIFU system in blood vessel of nude mice

該實驗結(jié)果證明，小型HIFU系統(tǒng)發(fā)射的超聲能夠?qū)⒃隗w血管內(nèi)的全氟戊烷微滴乳劑激發(fā)變成微泡。粒徑大小有一定差異，與微滴乳劑原有微泡粒徑存在差異有一定關(guān)系，也與不同部位的超聲強度分布不一致相關(guān)。而在體微滴轉(zhuǎn)化為微泡的動態(tài)過程及其對血管的損傷、對腫瘤的治療效果等，仍需要進一步的研究。

3 結(jié)論

實驗表明，適宜濃度的全氟戊烷微滴乳劑能夠加強小型HIFU系統(tǒng)焦域內(nèi)仿生物組織膠體對HIFU熱量的吸收，使在相同的HIFU參數(shù)下形成的熱凝固損傷范圍更大；但當全氟戊烷微滴乳劑的濃度過高時，將導致焦前區(qū)出現(xiàn)損傷，而焦域內(nèi)損傷反而受到抑制。此外，小型HIFU系統(tǒng)能夠在體內(nèi)激發(fā)微滴轉(zhuǎn)化為體積增大數(shù)十倍的氣泡，為后續(xù)在體動物實驗研究HIFU結(jié)合相變?nèi)焱槲⒌稳閯┑闹委熌[瘤打下了基礎(chǔ)。

[1] Al-Bataineh O,Jenne J,Huber P.Clinical and future applications of high intensity focused ultrasound in cancer[J].Cancer Treat Rev,2012.38(5):346-53.

[2]陳紅堅,甘娜,文勇,等.高強度聚焦超聲治療子宮肌瘤和子宮腺肌瘤的臨床應用[J].臨床超聲醫(yī)學雜志,2012.14(2):127-129.

[3]Zhang L,Chen WZ,Liu YJ,et al.Feasibility of magnetic resonance imaging-guided high intensity focused ultrasound therapy for ablating uterine fibroids in patients with bowel lies anterior to uterus[J].Eur J Radiol,2010.73(2):396-403.

[4]Kratzik C,Schatzl G,Lackner J,et al.Transcutaneous high-intensity focused ultrasonography can cure testicular cancer in solitary testis[J].Urology,2006.67(6): 1269-1273.

[5]Zhou CW,Li FQ,Qin Y,et al,Non-thermal ablation of rabbit liver VX2 tumor by pulsed high intensity focused ultrasound with ultrasound contrast agent:Pathological characteristics[J].World J Gastroenterol,2008.14(43): 6743-6747.

[6]Tran BC,Seo J,Hall TL,et al.Effects of contrast agent infusion rates on thresholds for tissue damage produced by single exposures of high-intensity ultrasound[J].IEEE Trans Ultrason Ferroelectr Freq Control,2005.52(7):1121-1130.

[7]Kripfgans OD,Fowlkes JB,Miller DL,et al.Acoustic droplet vaporization for therapeutic and diagnostic applications[J].Ultrasound Med Biol,2000.26(7): 1177-1189.

[8]Zhang M,Fabiilli ML,Haworth KJ,et al.Acoustic droplet vaporization for enhancement of thermal ablation by high intensity focused ultrasound[J].Acad Radiol,2011.18(9): 1123-1132.

[9]Fabiilli ML,Haworth KJ,Fakhri NH,et al.The role of inertial cavitation in acoustic droplet vaporization[J].IEEE Trans Ultrason Ferroelectr Freq Control,2009.56(5): 1006-1017.

[10]向昱,白景峰.自帶高精度定時功能的HIFU相位信號發(fā)生器[J].中國醫(yī)療器械雜志,2012.36(4):256-258.