米哚妥林對(duì)P糖蛋白介導(dǎo)的多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)作用

魏寅祥，趙 青，任志廣，賈硯寒，李新穎，黎 燕，彭 暉，馬遠(yuǎn)方

(1.河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞與分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，河南開封 475003;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所分子免疫室，北京 100850)

腫瘤多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)指患者接受化療藥物治療后對(duì)原來藥物及其他結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的抗癌藥產(chǎn)生耐藥的現(xiàn)象，是目前腫瘤化療失敗的主要原因。MDR的發(fā)生與多種因素有關(guān)，其中 ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-binding cassette transporter，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)能量依賴性地將結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的抗腫瘤藥物外排到腫瘤細(xì)胞外是產(chǎn)生MDR的主要原因之一[1]。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族包括48個(gè)成員，按其序列相似性可分為ABCA到ABCG7個(gè)大類。其中P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)、MDR相關(guān)蛋白(MDR associated-proteins，MRP)和乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)與MDR 關(guān)系最為密切[2]。

小分子蛋白激酶抑制劑(small molecular-protein kinase inhibitor，SM-PKI)通過抑制信號(hào)通路中關(guān)鍵位點(diǎn)抑制腫瘤細(xì)胞增殖和存活，是近年來抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)[3]。雖然具有靶向性強(qiáng)和副作用小等優(yōu)點(diǎn)，但臨床應(yīng)用中出現(xiàn)的耐藥現(xiàn)象依然是此類抗癌藥難以回避的問題[4]。研究報(bào)道，伊馬替尼誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞中P-gp過表達(dá)，提示P-gp可能與伊馬替尼耐藥具有相關(guān)性[5]。而最近越來越多的研究表明，多種SM-PKI如伊馬替尼、厄洛替尼、尼洛替尼、吉非替尼、蘭帕替尼、阿帕替尼和 MDRABC 間存在多種作用關(guān)系[5－9]。一方面 MDRABC會(huì)影響藥物的吸收、分布、代謝和清除，而另一方面一些親和力較高的PKI則被用于逆轉(zhuǎn)相應(yīng)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的MDR。因此，對(duì)于兩者間作用關(guān)系的研究無論對(duì)于臨床用藥還是新藥開發(fā)都具有重要的意義。

米哚妥林(midostaurin)是Novartis公司研究開發(fā)的抗腫瘤藥物，為蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、人 FMS樣酪氨酸蛋白激酶(FMS-like tyrosine kinase 3，F(xiàn)LT3)、KIT原癌基因蛋白，血管內(nèi)皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)，血小板衍生生長因子(plateletderived growth factor，PDGF)受體蛋白激酶抑制劑，通過阻斷激酶的活化抑制腫瘤細(xì)胞的分化與增殖。米哚妥林目前已經(jīng)進(jìn)入Ⅲ期臨床，主要應(yīng)用于白血病的治療[10]，但關(guān)于米哚妥林與P-gp及MDR之間作用關(guān)系少有報(bào)道。本文用P-gp高表達(dá)的耐藥細(xì)胞K562/A02及其親本細(xì)胞K562。在體外從細(xì)胞、功能、蛋白、基因和ATP水解酶活性等多個(gè)水平，對(duì)米哚妥林與P-gp間相互作用關(guān)系進(jìn)行評(píng)價(jià)，并對(duì)相關(guān)機(jī)制進(jìn)行探索。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

米哚妥林、羅丹明123(Rh-123)和DMSO購自美國Sigma公司;多柔比星、紫杉醇和長春新堿均購自浙江海正藥業(yè)有限公司;維拉帕米購自上海禾豐制藥有限公司;MTS細(xì)胞毒檢測(cè)試劑盒及V3601型P-gp-GloTM檢測(cè)系統(tǒng)購自美國Promega公司;BCA蛋白定量試劑盒購美國Thermo公司;抗P-gp單抗C219購自英國Abcam公司;AKT，pAKT(Ser473)，Erk和 pErk(Thr202/Tyr204)抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司;HRP標(biāo)記的羊抗兔和羊抗鼠二抗購自美國KPL公司;Trizol購自美國Invitrogen公司;TransScript First-Stand cDNA Synthesis Supermix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒自北京全式金公司;SYBR Green Realtime PCR Master Mix購自日本Toyobo公司;RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液購自美國Hyclone公司;胎牛血清購自元亨金馬;其余試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純?cè)噭?。?xì)胞培養(yǎng)板購自美國Corning公司;硝酸纖維素膜購自美國Millipore公司;X線片購自美國Kodak公司。

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，光學(xué)倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，高速臺(tái)式離心機(jī)(德國 Eppendorf公司)，多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)，流式細(xì)胞儀(美國 BD公司)，TD-20熒光光度計(jì)(美國PE公司)，紫外分光光度計(jì)(美國Spectronic Genesys 5公司)，實(shí)時(shí)定量PCR儀和 SDS-PAG電泳系統(tǒng)(美國 Bio-Rad公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞K562由本室保存，相應(yīng)的P-gp高表達(dá)耐藥細(xì)胞K562/A02為多柔比星誘導(dǎo)得到，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所藥物室熊冬生教授惠贈(zèng)。兩種細(xì)胞均以含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基置于37℃及5%CO2條件恒溫孵箱培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。其中K562/A02細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入多柔比星1.0 mg·L－1維持其耐藥性及P-gp的高表達(dá)，實(shí)驗(yàn)前1周停藥。

1.3 MTS法檢測(cè)米哚妥林細(xì)胞毒及逆轉(zhuǎn)耐藥作用

K562/A02與K562細(xì)胞分別以10%FBS的1640培養(yǎng)基懸浮，按照每180 μl 8×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔微孔板，在5%CO2，37℃條件下培養(yǎng)24 h。加入米哚妥林稀釋液20 μl至終濃度分別為0.2，0.5，1 和 5 μmol·L－1，于 5%CO2，37℃培養(yǎng)72 h。以5%DMSO組為對(duì)照，以1640培養(yǎng)基為本底。檢測(cè)時(shí)各組按每孔10 μl加入MTS，37℃孵育3 h測(cè)定492 nm吸光度值(absorbance，A)。細(xì)胞存活率(%)=A實(shí)驗(yàn)組/ADMSO組×100%。

K562/A02與K562細(xì)胞分別以10%FBS的1640培養(yǎng)基懸浮，按照8×103接種于96孔微孔板，在5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)24 h。分別按濃度梯度加入米哚妥林和維拉帕米溶液20 μl，孵育1 h后加入P-gp底物類抗癌藥，并將其濃度控制在IC10左右。K562/A02中多柔比星、紫杉醇和長春新堿在 K562/A02 中相應(yīng)濃度依次分別為 4 μmol·L－1，120和150 nmol·L－1，在K562中濃度為6，7.5和20 nmol·L－1。同時(shí)設(shè)置0.5‰DMSO 對(duì)照和抗癌藥單獨(dú)作用對(duì)照組。細(xì)胞存活率(%)=A實(shí)驗(yàn)組/ADMSO組×100%。MTS檢測(cè)及存活率計(jì)算同細(xì)胞毒性檢測(cè)。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)米哚妥林對(duì) P-gp的外排功能

收集K562/A02和K562細(xì)胞并計(jì)數(shù)，細(xì)胞按5×108L－1密度以10%FBS的1640培養(yǎng)基懸浮，分裝至1.5 ml EP管中待用。按終濃度米哚妥林和維拉帕米加入0.5 和10 μmol·L－1，以0.1%DMSO為陰性對(duì)照，37℃恒溫水浴30 min。除裸細(xì)胞外，各管加入 Rh-123 至終濃度 0.5 μmol·L－1，37℃避光孵育30 min。取出EP管，5000×g離心1 min，去上清，預(yù)冷生理鹽水洗滌2次，每次1 ml。300 μl預(yù)冷的生理鹽水重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)(通道為FL1-H，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長520 nm)，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=熒光值實(shí)驗(yàn)組/熒光值對(duì)照組。

1.5 Western印跡法檢測(cè)米哚妥林對(duì)耐藥細(xì)胞中P-gp的表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，按每孔5×105個(gè)細(xì)胞接種6孔板。接種24 h后，加入化合物繼續(xù)培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束，提取細(xì)胞總蛋白制備蛋白樣品;每孔加入等量待測(cè)蛋白，進(jìn)行SDSPAGE檢測(cè)(12%);電泳結(jié)束，硝酸纖維素膜覆蓋，冰浴下60 V轉(zhuǎn)印3 h;5%脫脂奶室溫封閉1 h;一抗(1∶1000稀釋)4℃孵育過夜;1×TBST洗滌3次，每次10 min;二抗(HRP-GAR，HRP-GAM，1∶2000稀釋)室溫孵育2 h;1×TBST洗滌3次，每次10 min;加入ECL顯色，暗室曝光。

1.6 定量PCR檢測(cè)米哚妥林對(duì)耐藥細(xì)胞中P-gp基因表達(dá)水平

取對(duì)數(shù)生長期K562/A02細(xì)胞，以按每孔5×105細(xì)胞接種6孔板，加入米哚妥林至終濃度0.5 μmol·L－1培養(yǎng) 72 h，1‰DMSO 作為陰性對(duì)照。培養(yǎng)結(jié)束，按照 Trizol試劑說明書提取細(xì)胞總RNA，稀釋后檢測(cè) A260nm和 A280nm，并換算為計(jì)算RNA含量。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提供體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，每 20 μl體系含 1 μg RNA。

定量PCR以前述cDNA為模板用SYBR Green Realtime PCR Super Mix按照以下體系進(jìn)行:SYBR Mix 10 μl，上下游引物各1 μl，cDNA 1 μl，ddH2O 7 μl，總體積共 20 μl。

反應(yīng)條件如下:① 95℃ 3 min;② 95℃持續(xù)30 s，60℃持續(xù)20 s 72℃持續(xù)20 s并收集熒光共30個(gè)循環(huán);③ 從60℃開始以0.5℃為一個(gè)梯度逐步升溫檢測(cè)直至95℃，繪制溶解曲線。

MDR1正向引物序列為:5'-AAATTGGCTTGACAAGTTGTATATGG-3'(26 bp)，反向:5'-CACCAGCATCATGAGAGGAAGTC-3'(23 bp);GAPDH正向:5'-CCGTCTAGAAAAACCTGCC-3'(19 bp)，反向:5'-GCCAAATTCGTTGTCATACC-3'(20 bp)。所有引物由北京諾賽公司合成。

1.7 P-gp-GloTM檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)米哚妥林對(duì)P-gp的ATP水解酶活性

P-gp的轉(zhuǎn)運(yùn)依賴于ATP的水解驅(qū)動(dòng)，化合物與P-gp相互作用會(huì)影響ATP酶活性。通過超速離心分離P-gp膜蛋白，并應(yīng)用P-gp-GloTM檢測(cè)系統(tǒng)提供的ATP依賴的螢火蟲熒光素酶發(fā)光效應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。P-gp首先與化合物共孵育，再添加入一定量的ATP，隨后終止P-gp ATP酶的反應(yīng)，剩余未被水解酶代謝的ATP用熒光素酶反應(yīng)體系被檢測(cè)。主要步驟如下:① 用試劑盒緩沖液分別稀釋米哚妥林、Na3VO4、維拉帕米和DMSO，DMSO終濃度均調(diào)整至 1%，使其終濃度為0.2 mmol·L－1，同時(shí)將提取的P-gp膜蛋白濃度稀釋至 1.5 g·L－1，均放于冰上待用;② 取0.5 ml EP管，標(biāo)號(hào)加入相應(yīng)化合物，置于冰上，各組有3個(gè)復(fù)孔。DMSO組加入20 μl 1%DMSO的檢測(cè)緩沖液;Na3VO4、維拉帕米和米哚妥林各組加入相應(yīng)20 μl化合物0.1 mmol·L－1(在50 μl體系中，最終工作濃度為 40 μmol·L－1);③ 每管加入 20 μl P-gp 1.5 g·L－1，37℃ 孵育5 min;④EP管取出，置于冰上，每管加10 μl MgATP 25 mmol·L－1，37℃孵育40 min;⑤ 取出EP 管，按標(biāo)記號(hào)加入不透光96孔白板孔內(nèi)，每孔另加50 μl ATP檢測(cè)試劑，室溫反應(yīng)20 min后用熒光光度計(jì)測(cè)量熒光強(qiáng)度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 米哚妥林對(duì)細(xì)胞存活的影響

如圖1所示，米哚妥林在P-gp高表達(dá)的耐藥細(xì)胞K562/A02及其對(duì)應(yīng)的敏感細(xì)胞K562細(xì)胞中毒性無顯著差異，米哚妥林 0.5 μmol·L－1對(duì)兩種細(xì)胞均無明顯殺傷作用，存活率均可達(dá)到80%以上。

Fig.1 Cytotoxic effect of midostaurin in sensitive and resistant cells by MTS assay.K562/A02 and K562 cells were seeded in 96-well plate followed by addition of midostaurin.Survival rate(%)=AExperiment/AControl×100%.K562/A02 or K562 cells were treated with midostaurin 0.5，1 and 5 μmol·L －1followed by MTS assay.±s，n=3.

2.2 米哚妥林對(duì)K562/A02及K562細(xì)胞的增敏作用

將無毒劑量的底物類抗癌藥與不同濃度梯度的米哚妥林在K562和K562/A02細(xì)胞中共同作用評(píng)價(jià)其逆轉(zhuǎn)MDR的效果，以維拉帕米為陽性對(duì)照。結(jié)果表明，米哚妥林 0.5 μmol·L－1可顯著恢復(fù)K562/A02對(duì)多柔比星的耐藥(圖2A)，且米哚妥林0.5 μmol·L－1作用效果(細(xì)胞存活率 40%)與維拉帕米 2.5 μmol·L－1作用效果接近。對(duì)長春新堿(圖2B)和紫杉醇(圖2C)亦有部分增敏，但效果不如維拉帕米。對(duì)親本敏感細(xì)胞K562無效果，表明米哚妥林通過對(duì)P-gp的作用起到逆轉(zhuǎn)效果。

Fig.2 Effect of midostaurin on sensitization of drug resistance mediated by P-gp.K562/A02 or K562 cells were treated with doxorubicin(A)，vincristine(B)，paclitaxel(C)，and midostaurin 0，0.25 and 0.5 μmol·L －1added into cells for 24 h.Verapamil was used as positive control drug.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with DMSO control group.

2.3 米哚妥林對(duì)P-gp外排功能的影響

如圖3所示，米哚妥林可顯著增加Rh-123在K562/A02細(xì)胞中的積累，表明其對(duì)P-gp的外排活性具有抑制作用。同時(shí)，米哚妥林0.5 和10 μmol·L－1效果均優(yōu)于維拉帕米。而在K562細(xì)胞中則無抑制作用。

Fig.3 Effect of midostaurin on the intracellular Rh-123 accumulation.Rh-123 accumulation in K562/A02 or K562 cell following a 30 min incubation in the absence or presence of midostaurin or verapamil 0.5 and 10 μmol·L －1 .0.1%DMSO was taken as control and the results were presented as change fold of fluorescence intensity in treatment group relative to DMSO vehicle.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with vehicle control group.

2.4 米哚妥林對(duì)P-gp基因與蛋白表達(dá)水平的影響

圖4 結(jié)果表明，米哚妥林0.5 μmol·L－1作用72 h后，在K562/A02細(xì)胞中的米哚妥林對(duì)P-gp蛋白(圖4A)和基因(圖4B)均無顯著影響。

Fig.4 Effect of midostaurin on human P-gp protein expression by Western boltting(A)and mRNA expression by qPCR(B).Lane 1:vehicle control;lane 2:midostaurin 0.5 μmo·lL－1.±s，n=3.

2.5 米哚妥林對(duì)耐藥和敏感細(xì)胞中信號(hào)通路分子的影響

米哚妥林的作用靶點(diǎn)包括PKC，F(xiàn)LT3和KIT，可作用于Raf/MEK/ERK通路。通過檢測(cè)了逆轉(zhuǎn)條件下米哚妥林K562和K562/A02中AKT和ERK的表達(dá)及磷酸化水平變化，以探索其逆轉(zhuǎn)耐藥的機(jī)制是否與其激酶抑制活性相關(guān)。如圖5所示，米哚妥林0.5 μmol·L－1處理72 h 后對(duì)耐藥和敏感細(xì)胞中 AKT和ERK的表達(dá)及磷酸化水平均無顯著影響。

2.6 米哚妥林對(duì)P-gp的ATP水解酶活性的影響

與對(duì)照組相比，熒光信號(hào)的減弱表示被P-gp ATP酶消耗的ATP量，因此信號(hào)降低的越多，P-gp ATP酶活性越高，可認(rèn)為P-gp的底物。反之，信號(hào)的增強(qiáng)表明，ATP酶活性被抑制，化合物P-gp的為抑制劑。在本實(shí)驗(yàn)中，試劑盒提供的Na3VO4為抑制劑對(duì)照，維拉帕米為底物對(duì)照。如圖6所示，米哚妥林不激活P-gp的ATP酶活性，可能不是ATP酶的底物。

Fig.6 Effect of midostaurin on P-gp ATPase activity.Crude membranes from K562/A02 cells were incubated with DMSO or midostaurin 40 μmol·L －1diluted with buffer solution and MgATP 5 mmo·lL－1at 37℃for 40 min.Relative light units(RLU)represent the level of ATP in the sample，exhibiting a negative relationship with activity of P-gp ATPase.Sodium vanadate(Vi)and topotecan(TOPT)40 μmol·L －1were used as inhibitor and substrate control respectively.±s，n=3.*P＜0.05，＊＊ P＜0.01，compared with vehicle group.

3 討論

P-gp是于20世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)的首個(gè)耐藥相關(guān)蛋白，在結(jié)腸癌、直腸癌與腎癌等腫瘤中可原發(fā)性高表達(dá)，在急性白血病、淋巴瘤、小細(xì)胞肺癌、卵巢癌等腫瘤化療中可獲得性表達(dá)，臨床資料顯示P-gp過表達(dá)與患者的不良預(yù)后有關(guān)[11]。P-gp的底物主要包括蒽環(huán)類物 (多柔比星和柔紅霉素)、植物堿(長春新堿和長春堿)、紫杉烷(紫杉醇和多西紫杉醇)類普遍在臨床上使用的腫瘤化療藥物[12]，而近年的研究表明，P-gp亦有可能與伊馬替尼等多種新型激酶抑制劑的臨床耐藥相關(guān)[5]。

近30年來，一直致力于對(duì)多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑的開發(fā)。以維拉帕米、環(huán)菌素A等第一代逆轉(zhuǎn)劑為代表，其特征多為P-gp底物，依靠與其他藥物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合并外排發(fā)揮抑制作用，但由于其與P-gp親和力較低，一般使用劑量較大，并且伴有明顯的毒性作用[13]。通過對(duì)第一代逆轉(zhuǎn)劑進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，發(fā)展了以維拉帕米右旋同分異構(gòu)體、PSC833(環(huán)孢素A衍生物)和VX-710為代表的第二代逆轉(zhuǎn)劑。與第一代相比，它們的主要特點(diǎn)是具有較低的細(xì)胞毒作用，且逆轉(zhuǎn)MDR作用明顯增強(qiáng)，但限制其臨床應(yīng)用的主要障礙是與抗腫瘤藥物合用時(shí)干擾后者的藥代動(dòng)力學(xué)[14]。目前以高效低毒、高親和力、非P-gp底物、無明顯藥代動(dòng)力學(xué)改變?yōu)橹饕卣鞯牡谌嗨幠退幠孓D(zhuǎn)劑正在研發(fā)中。

本研究中，米哚妥林 0.5 μmol·L－1(IC20以內(nèi))即可在功能水平有效逆抑制P-gp的外排活性，在細(xì)胞水平可逆轉(zhuǎn)P-gp介導(dǎo)的MDR，表現(xiàn)出較好的逆轉(zhuǎn)活性，同時(shí)在ATP酶實(shí)驗(yàn)中表明其可能不是P-gp的底物。而已有報(bào)道表明米哚妥林臨床使用其血藥濃度可達(dá)到 771～4649 nmol·L－1[15]，大于本研究采用的 0.5 μmol·L－1。這表明了這一逆轉(zhuǎn)策略應(yīng)用的可行性。但是，近期研究表明米哚妥林在肝中需通過CYP3A4酶進(jìn)行代謝[16]。這使得米哚妥林這種新型的激酶抑制劑是否能作為P-gp抑制劑直接開發(fā)應(yīng)用還有待體內(nèi)進(jìn)一步研究，因?yàn)槊走嵬琢志哂蠵-gp抑制作用和CYP3A4底物的特性，這表明其很可能會(huì)影響其他藥物的藥代動(dòng)力學(xué)，在與其他化療藥物(特別是P-gp底物)聯(lián)用時(shí)要在用藥的劑量、時(shí)序等方面給予特別的重視。但是，鑒于目前投入臨床試驗(yàn)的化合物多是在已知的活性化合物骨架結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上改造、修飾通過對(duì)其衍生物藥效學(xué)篩選得到，而至今仍沒有一種小分子P-gp抑制劑被投入臨床應(yīng)用，因此，人們需要尋找更多全新結(jié)構(gòu)的化合物，為未來多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑的開發(fā)提供更多空間。所以米哚妥林以其前述特征可作為一種P-gp逆轉(zhuǎn)劑的先導(dǎo)化合物骨架可考慮列入。

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