芪丹通脈片對(duì)心肌梗死大鼠缺血心肌血管新生及HIF-1α、VEGF 表達(dá)的影響*

衣 慧 王俊超 司靜文 張玉芬 王宗仁 李軍昌△

（1.第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院，陜西 西安 710032；2.山東省壽光市中醫(yī)院，山東 壽光 262700）

缺血性心臟病嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康，其發(fā)病率和死亡率近年來(lái)逐漸上升，其病理特點(diǎn)是心肌血管的狹窄或堵塞，導(dǎo)致心肌梗死。在中醫(yī)學(xué)中缺血性心臟病屬“胸痹”、“心痛”范疇，氣虛血瘀，脈絡(luò)不暢是其病機(jī)關(guān)鍵［1-2］。急性心梗發(fā)生后的再灌注療法可恢復(fù)缺血組織的血供，有效地挽救缺血組織，但是，再灌注療法受缺血組織血管再通時(shí)間的限制并存在再灌注損傷等問(wèn)題［3］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)心梗SD 大鼠模型應(yīng)用芪丹通脈片（QDTMT）來(lái)觀察心梗大鼠氣虛血瘀表征、缺血心肌血管新生及缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）mRNA 及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）mRNA的表達(dá)，并探討其可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物 SD 大鼠80 只，雄性，體質(zhì)量（230±20）g，該實(shí)驗(yàn)經(jīng)第四軍醫(yī)大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：No.0022401。

1.2 藥物及儀器 QDTMT 提取浸膏干粉（藥物組成為黃芪30 g，當(dāng)歸15 g，丹參30 g，紅花30 g，桂枝10 g。1 g 干粉相當(dāng)于2.86 g 生藥）由第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院中醫(yī)科提供。小鼠抗大鼠CD31抗體（美國(guó)Abcam 公司）；小鼠抗大鼠免疫組化試劑盒（北京正四柏生物科技有限公司）；Trizol（Gibco 公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Master Mix（日本TaKaRa 公司）；小動(dòng)物呼吸機(jī)（BW-BM1103-200 型，上海軟隆科技發(fā)展有限公司）；光學(xué)顯微鏡（尼康）；體式顯微鏡（Olymps）；超薄切片機(jī)（LEICA CM 1900）；RT-PCR 儀（BIO-RAD）。

1.3 造模與分組 雄性SD 大鼠腹腔注射30 g/L 戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉后，經(jīng)口氣管插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)。于左側(cè)胸骨旁3、4 肋間打開(kāi)胸腔，暴露心臟，以7-0 絲線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，待左室前壁變蒼白時(shí)，說(shuō)明MI 模型已建立成功。然后逐層關(guān)胸并排出胸腔氣體。另設(shè)假手術(shù)（Sham）組18 只，只在相同部位穿線并不結(jié)扎，余步驟相同。待大鼠自主呼吸后撤去呼吸機(jī)。術(shù)后24 h 大鼠存活72 只，除Sham 組的18 只外，隨機(jī)分為梗死組（MI 組）、MI+芪丹通脈片小劑量（MI+QDTMTL）組和MI+芪丹通脈片大劑量（MI+QDTMTH）組 各18 只，其 中MI+QDTMTL 組 給 予QDTMT 浸膏干粉0.36 g/kg，MI+QDTMTH 組3.24 g/kg，Sham 組和MI 組給予生理鹽水3 mL/kg，QDTMT 浸膏干粉溶于生理鹽水中各組等體積灌胃，每日灌胃1次。

1.4 動(dòng)態(tài)觀察（1）一般情況。4 周后觀察大鼠精神狀態(tài)、皮毛色澤、五官爪甲顏色及尾部特征等。（2）舌下脈絡(luò)。實(shí)驗(yàn)第4 周時(shí)分別對(duì)各組大鼠進(jìn)行30 g/L 戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，用兩根細(xì)線分別將大鼠的上下牙拉開(kāi)后，用濕棉簽輕觸舌面，舌體伸出，并翻轉(zhuǎn)顯露舌下脈絡(luò)，在自然光線下觀察其舌色及舌底脈絡(luò)。針對(duì)氣虛血瘀證出現(xiàn)的青紫舌，主要從舌色和舌底靜脈長(zhǎng)度的兩個(gè)方面擬定了量化評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：正常舌—底色微青、舌靜脈主干長(zhǎng)度不超過(guò)舌體3/4，記為0 分；輕度紫暗—舌底色紫暗或舌靜脈主干長(zhǎng)度超過(guò)舌體3/4，記為1 分；明顯紫暗—舌底色紫暗且舌靜脈主干長(zhǎng)度超過(guò)舌體3/4，記為2 分。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 4 周后，稱(chēng)取大鼠體質(zhì)量，腹腔注射30 g/L 戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，打開(kāi)大鼠胸腔，充分暴露心臟，剪開(kāi)右心耳用PBS 及40 g/L 多聚甲醛灌注，待心臟變白后取出心臟，每只大鼠沿結(jié)扎線向下取0.3 cm 厚心臟橫斷面組織1 塊，40 g/L 多聚甲醛中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，制作5 μm的石蠟切片。另，部分大鼠于第7日、14日及28日時(shí)心臟取材，打開(kāi)胸腔后PBS 灌注，取下部分非梗死心肌組織放入預(yù)冷的Trizol 中，用于提取心肌總RNA。（1）檢測(cè)心梗邊緣區(qū)CD31的表達(dá)。采用小鼠抗大鼠免疫組化試劑盒進(jìn)行免疫組化染色。石蠟切片常規(guī)脫蠟、入水、抗原修復(fù)；切片浸入3%H2O2中浸泡10 min，PBS 洗2 min×3次；加試劑A 封閉10 min，PBS 洗2 min×3次；加入1∶100 小鼠抗大鼠CD31 單克隆抗體，置于濕盒中4℃過(guò)夜。PBS 洗后加試劑B 孵育10 min，PBS 洗2 min×3次，再加試劑C 孵育10 min，PBS 洗2 min×3次；DAB顯色；自來(lái)水充分沖洗后，復(fù)染，鹽酸酒精分化，脫水、透明、封片、鏡檢。（2）測(cè)定各組大鼠心梗邊緣區(qū)微血管數(shù)、微血管密度。心肌組織經(jīng)CD31免疫組化染色后的切片，采用Weidner 法計(jì)數(shù)MVD［4］，經(jīng)圖像分析儀分析系統(tǒng)分析處理，先在40×的光鏡視野下找到心梗邊緣區(qū)血管密度最高的5個(gè)區(qū)域，然后在400×視野下計(jì)數(shù)血管高密度區(qū)血管數(shù)目，凡是染成棕黃色單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇均作為一個(gè)血管計(jì)數(shù)，管腔內(nèi)徑大于20 μm 或有較厚肌層（3 層以上）的則不予計(jì)數(shù)。每張切片隨機(jī)選5個(gè)視野，計(jì)數(shù)MVC，取其平均值即平均微血管數(shù)目作為本例大鼠的MVC 值；用HPIAS-1000型高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)測(cè)定其陽(yáng)性染色面積比（MVD），具體計(jì)算方法為MVD=MVC2/mm2。（3）心梗后7 d、14 d 和28 d，各組大鼠隨即抽取6 只常規(guī)心臟取材，提取總RNA，用RT-PCR 方法檢測(cè)各組大鼠HIF-1α 及VEGF mRNA的表達(dá)情況，①RNA 提取：按照Trizol的說(shuō)明書(shū)提取心肌總RNA，并溶于50 μg DEPC 水處理水中。②RT 反應(yīng)：取2 μg 總RNA，按照Super ScriptTMⅡRNase H-Reverse Transcriptase（Invitrogen 公司）的說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。③PCR 反應(yīng)：反應(yīng)體系為20 μg。擴(kuò)增HIF-1α 基因的引物序列：Forward：5'-CAGCAGACCCAGTTACAGAA-3'，Reverse：5'-TC AGTFAACTFGATCCAAAGCTCT-3'；VEGF 基因的引物序列：Forward：5'-TGCACCCACGACAGAAGGG-3'：Reverse：5'-TCACCGCCTTGGCTTGTCACAT-3'；擴(kuò)增內(nèi)參β-actin 基因的引物序列：Forward：5'-AGGTGACAGCATYGCTTCTG-3'；Reverse：5'-GCTGCCTCAA CACTCAAC-3'，引物均由北京賽百盛生物工程公司合成。按照TaKaLa 實(shí)時(shí)定量試劑盒加樣，通過(guò)PCR 儀器進(jìn)行檢測(cè)，PCR的反應(yīng)條件為：95℃10 min，95℃15 s，60℃1 min，共40個(gè)循環(huán)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用GraphPad Prism5.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，組間均值兩兩比較采用SNK 或Dunnett T3檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠氣虛血瘀表征的變化

2.1.1 各組一般情況比較 見(jiàn)表1。

表1 各組一般情況比較

2.1.2 舌下脈絡(luò) Sham 組大鼠舌色淡紅，舌下脈絡(luò)清晰紅潤(rùn)，舌象綜合評(píng)分為0 分（93.33%）；MI 組大鼠舌色紫暗，舌下脈絡(luò)擴(kuò)張，青紫粗長(zhǎng)，舌象綜合評(píng)分以2分為主（80.00%）；MI+QDTMTL 組大鼠舌色暗紅，舌下脈絡(luò)較Sham 組增粗增長(zhǎng)，舌象綜合評(píng)分以1 分為主（66.67%）；MI+QDTMTH 組大鼠舌色紅潤(rùn)，舌下脈絡(luò)較Sham 組略增粗增長(zhǎng)，舌象綜合評(píng)分以1 分為主（86.67%）。

2.2 CD31單克隆抗體免疫組化染色結(jié)果 見(jiàn)圖1。MI+QDTMTL 組和MI+QDTMTH 組CD31的表達(dá)較MI組增強(qiáng)，且MI+QDTMTH 組高于MI+QDTMTL 組。

2.3 各組大鼠心梗邊緣區(qū)微血管數(shù)、微血管密度的比較 見(jiàn)表2。Sham 組、MI 組、MI+QDTMTL 組和MI+QDTMTH 組均可看到新生的微血管，但Sham 組微血管增生不明顯，MI 組可看到少量的微血管增生，MI+QDTMTL 組可看到較多量的微血管增設(shè)，而MI+QDTMTH 組可見(jiàn)到大量的微血管增生。

圖1 CD31單克隆抗體免疫組化染色結(jié)果（×200）

表2 各組大鼠心梗邊緣區(qū)微血管數(shù)及微血管密度比較（±s）

表2 各組大鼠心梗邊緣區(qū)微血管數(shù)及微血管密度比較（±s）

與Sham 組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與MI 組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與MI+QDTMTL 組比較，▲P＜0.05。

2.4 芪丹通脈片對(duì)各組大鼠HIF-1α mRNA 及VEGF mRNA 表達(dá)的影響 見(jiàn)圖2。結(jié)果如下：（1）7 d時(shí)，與Sham 組相比，其余各組HIF-1α mRNA 急劇升高（P＜0.01），以MI+QDTMTH 組表現(xiàn)最為明顯；各組VEGF mRNA的表達(dá)也有所升高（P＜0.05）；（2）14 d時(shí)，除Sham 組外，各組HIF-1α mRNA的表達(dá)繼續(xù)增高，與MI 組相比，MI+QDTMTL 組和MI+QDTMTH 組HIF-1α的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），且以MI+QDTMTH組增高更為顯著；除Sham 組外，各組VEGF mRNA的表達(dá)有所降低，MI+QDTMTL 組和MI+QDTMTH 組同MI 相比仍然具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；（3）28 d時(shí)，MI+QDTMTL 組和MI+QDTMTH 組HIF-1α mRNA的水平明顯降低，與MI 組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05 或0.01），VEGF mRNA的表達(dá)也有所降低，與MI 組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

3 討論

近年來(lái)，中醫(yī)藥在治療性血管再生中的作用倍受關(guān)注［5］，益氣活血法在缺血心肌治療性血管再生中有著重要的指導(dǎo)意義。芪丹通脈片是在中醫(yī)氣血理論指導(dǎo)下，通過(guò)臨床辨證而研制的復(fù)方中成藥，已獲得國(guó)家新藥證書(shū)（國(guó)藥證字Z20090035）和國(guó)家新藥批準(zhǔn)文號(hào)（國(guó)藥準(zhǔn)字Z20090252），既往實(shí)驗(yàn)證明其具有改善心肌缺血程度及減少心肌缺血范圍的作用，并對(duì)急性心肌缺血危險(xiǎn)因素高血脂、高血黏、冠心病、心絞痛有較好的治療作用［6-7］，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，芪丹通脈片能夠改善心梗大鼠氣虛血瘀癥狀，促進(jìn)梗死邊緣區(qū)的血管新生，一定時(shí)間內(nèi)能夠上調(diào)HIF-1α 與VEGF mRNA的表達(dá)，且高劑量組比低劑量組療效更加明顯。

圖2 大鼠心肌梗死后心肌組織中HIF-1αmRNA 及VEGF mRNA 水平的變化

HIF-1α 是在缺氧/缺血條件下，哺乳動(dòng)物組織細(xì)胞產(chǎn)生的一種由HIF-1α 亞基和HIF-1β 亞基組成的核轉(zhuǎn)錄因子，HIF-1α 是HIF-1的活性亞基和氧調(diào)節(jié)亞基［8］，在非低氧細(xì)胞中幾乎不表達(dá)，在缺氧條件下表達(dá)明顯增加，而HIF-1β 幾乎在所有細(xì)胞中廣泛表達(dá)且不受氧張力的影響［9-10］。VEGF 是HIF-1α的下游靶基因，是內(nèi)皮細(xì)胞特異性的促有絲分裂原，主要生物學(xué)功能是促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、新生血管形成和增加血管通透性。HIF-1α 作為引發(fā)各種缺氧應(yīng)激蛋白表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，在缺血的適應(yīng)性反應(yīng)中起核心作用，它可以通過(guò)促進(jìn)下游相關(guān)基因如VEGF 等的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而使機(jī)體對(duì)缺血、缺氧產(chǎn)生代償性適應(yīng)反應(yīng)［11］。HIF-1α被認(rèn)為是缺血環(huán)境血管新生的“發(fā)動(dòng)機(jī)”［12-13］。在缺血心肌中穩(wěn)定表達(dá)的HIF-1α 信號(hào)不僅能促細(xì)胞存活和血管新生，而且促進(jìn)側(cè)支循環(huán)的形成，且新生血管具有正常血管相似的結(jié)構(gòu)，無(wú)血管滲漏現(xiàn)象［14］。局部注射穩(wěn)定表達(dá)HIF-1α的腺病毒表達(dá)質(zhì)粒后，可形成具有周?chē)?xì)胞包繞的出牙毛細(xì)血管。VEGF 是HIF-1α 介導(dǎo)的血管新生的關(guān)鍵下游因子［15］。然而，單獨(dú)應(yīng)用VEGF 刺激所形成的新生血管表現(xiàn)出形態(tài)不完整、存在滲漏現(xiàn)象［16］，這些研究表明HIF-1α 是缺血心肌治療性血管新生與穩(wěn)定的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明大鼠心梗后1 周、2 周，心肌中HIF-1α 及VEGF表達(dá)升高，且芪丹通脈片治療組要高于MI 組，4 周后，HIF-1α 及VEGF 表達(dá)相應(yīng)下調(diào)，芪丹通脈片治療組要低于MI 組，大劑量組低于小劑量組，筆者推測(cè)可能是芪丹通脈片能夠促進(jìn)能夠活化HIF-1α 信號(hào)分子，上調(diào)HIF-1α 及VEGF的表達(dá)從而促進(jìn)非梗死區(qū)血管新生，且呈劑量依賴(lài)性，隨著新生血管生成后，心肌缺血缺氧得到改善，HIF-1α 及下游VEGF的表達(dá)又相應(yīng)下調(diào)。

綜上所述，HIF-1α 在缺血性心臟病治療性血管新生與成熟過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用，益氣活血復(fù)方芪丹通脈片能夠上調(diào)HIF-1α 下游的VEGF 來(lái)介導(dǎo)血管新生，通過(guò)活化HIF-1α 信號(hào)來(lái)影響新生血管的成熟與穩(wěn)定，然而目前對(duì)HIF-1α 調(diào)控血管成熟的機(jī)制尚不明確，后期筆者將對(duì)這一現(xiàn)象展開(kāi)研究。

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