結腸癌組織 AQP1與 MMP-2、MMP-9、TIMP-1表達的關系及意義

石曉明 吳勝春 唐雷 楊永賓 呂柏楠

研究證實，水通道蛋白1(AQP1)在宮頸癌、結直腸癌、肺癌等多種惡性腫瘤中均存在高表達［1－4］，對腫瘤細胞的侵襲、黏附、轉移等多種生物學行為都具有調節(jié)作用，已成為惡性腫瘤生物治療的潛在靶點。但迄今關于AQP1的具體作用機制尚未完全闡明，有關AQP1在結腸癌組織中表達及意義的研究筆者也不多見。因此，本研究檢測 AQP1、基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)、基質金屬蛋白酶組織抑制因子-1(TIMP-1)在結腸癌及癌旁組織中的表達，對結腸癌組織中這些蛋白質之間的關系進行分析，對AQP1在結腸癌中的作用和意義進行了初步探討。

1 資料與方法

1．1 一般資料 選擇2007年9月至2010年10月在我院普外科就診患者54例，其中男40例，女14例;年齡38～74歲，中位年齡58歲。所有患者均手術并有術后確診病理。取原發(fā)癌石蠟標本，并取其中40例的癌旁組織標本。

1．2 免疫組化染色(SP 法)檢測 AQP1、MMP-2、MMP-9、TIMP-1蛋白表達 兔抗人 AQP1、MMP-2、MMP-9、TIMP-1多克隆抗體均為美國Santa Cruz公司產品，免疫組化試劑盒為邁新生物技術公司產品。均采用SP法分別對腫瘤組織和癌旁組織進行各指標的免疫組化染色。石蠟標本連續(xù)4 μm切片，脫蠟水化后3%過氧化氫孵育，蒸餾水沖凈后以磷酸鹽緩沖液(PBS)浸泡進行抗原修復。嚴格按免疫組化試劑盒要求進行操作:工作液封閉、加入一抗、孵育并沖洗后依次加二抗工作液、辣根酶標記鏈酶卵白素工作液。DAB顯色，蘇木素復染后進行脫水，最后中性樹脂封片，分別進行HE和免疫組化染色。

1．3 免疫組化結果判斷標準 由兩位病理學醫(yī)師雙盲閱片判斷免疫組化結果。每張石蠟切片在鏡下隨機取5個400倍視野，每視野計數 100 個細胞，AQP1、MMP-2、MMP-9、TIMP-1 以細胞漿呈黃色為染色陽性，按腫瘤細胞著色強度和陽性細胞率分別進行記分。按著色強度記分:無著色記0分，淡黃色記1分，黃色記2分，棕黃色記3分。按腫瘤細胞陽性細胞率記分:陽性細胞≤5%(0分)，6% ～25%(1分)，26% ～50%(2分)，51% ～75%(3分)，≥76%為(4分)。兩種記分結果相乘為0～1記為陰性(－)，2～3記為弱陽性(+)，4～7陽性(++)，≥8強陽性(+++)。

1．4 統(tǒng)計學分析 應用SAS 8．0統(tǒng)計軟件，等級資料比較采用秩和檢驗，相關關系采用Spearman等級相關分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2．1 結腸癌和癌旁組織中 AQP1、MMP-2、MMP-9、TIMP-1蛋白表達強度 45例結腸癌組織中 AQP1、MMP-2、MMP-9、TIMP-1陽性表達率分別為 75．93%、64．81%、77．78%、46．30%;癌旁組織中這4種蛋白質表達陽性率分別為22．50%、37．50%、50．00%、70．00%。經比較，AQP1、MMP-2、MMP-9 在結腸癌組織中的表達均較癌旁組織增強，而TIMP-1在癌旁組織中表達高于癌組織(P ＜0．05)。見表1。

表1 結腸癌和癌旁組織AQP1、MMP-2、MMP-9、TIMP-1的表達情況 例

2．2 結腸癌和癌旁組織中 AQP1、MMP-2、MMP-9、TIMP-1蛋白表達的關系 AQP1與MMP-2、AQP1與MMP-9間表達強度量正相關(r值分別為 0．4030 和 0．3874，P ＜0．01)，MMP-2 與TIMP-1、MMP-9與 TIMP-1之間表達呈負相關(r值分別為－0．3176和 －0．4728，P ＜0．05)。

3 討論

近年來結腸癌的發(fā)生率在我國明顯上升，作為一種全身性疾病嚴重威脅群眾的健康。由于該病起病比較隱匿、多無明顯特異性癥狀，患者就診時經常已處于晚期，治療效果不佳，預后差。而有關影響結腸癌侵襲轉移的基因目前還不完全明確。因此，尋找影響結腸癌進展的基因對于確定新的腫瘤標志物、分析結腸癌發(fā)生進展機制、尋找腫瘤基因治療靶標有重要意義。AQP1即為目前受到關注的基因之一，AQP1為水通道蛋白家族的成員之一，基因定位于染色體7p14，蛋白質分子量為28 kD，以四聚體形式存在于細胞膜上。AQP1的主要功能為轉運水分子，還可轉運甘油及其他小分子物質［5］。國內外均有研究發(fā)現(xiàn)AQP1在宮頸癌、結直腸癌、肺癌等多種惡性腫瘤中均存在高表達，可促進腫瘤新生血管的形成，導致腫瘤的侵襲、轉移［1－4］。體外實驗表明，抑制其表達可有效逆轉腫瘤細胞的侵襲轉移能力［4，6］。說明AQP1與腫瘤侵襲轉移關系密切。本研究顯示，AQP1在結腸癌組織中的表達明顯高于癌旁組織(P＜0．01)，說明AQP1與結腸癌關系密切，對其功能進行分析可為結腸癌發(fā)生進展機制研究提供依據。

AQP1的調控機制目前還不完全清楚。但有研究表明AQP1可以通過影響p38MAPK通路的活性而使膀胱癌細胞的侵襲遷移活性發(fā)生改變［7］。目前關于AQP1與結腸癌侵襲轉移能力關系的研究尚不多見，故本研究對AQP1和反應腫瘤細胞侵襲黏附能力的 MMP-2、MMP-9、TIMP-1之間的關系進行了分析。MMPs可以降解細胞外環(huán)境中的蛋白質、破壞腫瘤細胞侵襲的體內屏障，導致腫瘤細胞侵襲轉移至其他部位［8］。MMP-2和MMP-9是MMPs家族中的重要成員，可直接促進結腸癌的侵襲轉移［9］。TIMP1則是 MMP-2、MMP-9的抑制物，可以抑制腫瘤的侵襲轉移［10］。本研究發(fā)現(xiàn)AQP1與MMP-2、AQP1與MMP-9表達呈正相關，提示AQP1可能通過促進MMP-2、MMP-9表達而導致結腸癌細胞侵襲、黏附能力增強。但本研究并未發(fā)現(xiàn)AQP1與TIMP-1之間有關。我們推測這可能是在結腸癌細胞中AQP1只能調控部分侵襲相關因子，且AQP1、TIMP-1對腫瘤細胞所起的調控作用位于侵襲黏附過程的不同水平，所以關系并不明顯。

本研究證實了AQP1在結腸癌組織中表達增高，AQP1可能通過影響MMP-2、MMP-9的表達而促進結腸癌細胞侵襲轉移。但我們也發(fā)現(xiàn)結腸癌細胞中影響腫瘤細胞侵襲功能的基因網絡化調節(jié)極其復雜，有關AQP1的具體功能尚待進一步深入研究。

1 Shi YH，Chen R，Talafu T，et al．Significance and expression of aquaporin 1，3，8 in cervical carcinoma in Xinjiang Uygur women of China．Asian Pac J Cancer Prev，2012，13:1971-1975．

2 裴海平，劉卓，黃林生，等．水通道蛋白1和3在結直腸癌組織中的表達及其意義．中華胃腸外科雜志，2011，14:275-278．

3 王楠，肖英紅，王宇，等．利用組織芯片檢測水通道蛋白1在乳腺癌組織中的表達．中國實驗診斷學，2011，15:402-403．

4 Xie Y，Wen X，Jiang Z，et al．Aquaporin 1 and aquaporin 4 are involved in invasion of lung cancer cells．Clin Lab，2012，58:75-80．

5 胡科，楊繼元．水通道蛋白1與腫瘤．微循環(huán)學雜志，2011，21:81-83．

6 Jiang Y．Aquaporin-1 activity of plasma membrane affects HT20 colon cancer cell migration．IUBMB Life，2009，61:1001-1009．

7 Pan XY，Guo H，Han J，et al．Ginsenoside Rg3 attenuates cell migration via inhibition of aquaporin 1 expression in PC-3M prostate cancer cells．Eur J Pharmacol，2012，683:27-34．

8 Pytliak M，Vargová V，Mechírová V．Matrix metalloproteinases and their role in oncogenesis:a review．Onkologie，2012，35:49-53．

9 Zhang XX，F(xiàn)u Z，Zhang Z，et al．Microcystin-LR Promotes Melanoma Cell Invasion and Enhances Matrix Metalloproteinase-2/-9 Expression Mediated by NF-κB Activation．Environ Sci Technol，2012，46:11319-11326．

10 Bourboulia D，Stetler-Stevenson WG．Matrix metalloproteinases(MMPs)and tissue inhibitors of metalloproteinases(TIMPs):Positive and negative regulators in tumor cell adhesion．Semin Cancer Biol，2010，20:161-168．