二甲基亞砜對(duì)離體豬皮膚組織的拉曼光譜的影響＊

鐘會(huì)清，劉智明，倪藝榕，熊紅蓮，郭周義

(華南師范大學(xué)生物光子學(xué)研究院，激光生命科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和中醫(yī)藥與光子技術(shù)國(guó)家中醫(yī)藥管理局三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510631)

0 引言

拉曼光譜技術(shù)(Raman)是從物質(zhì)的分子振動(dòng)光譜來(lái)識(shí)別和區(qū)分不同的物質(zhì)結(jié)構(gòu)的一種技術(shù)，具有快速、簡(jiǎn)單、無(wú)損、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，已成為研究物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的重要手段，被公認(rèn)為是研究分子結(jié)構(gòu)和功能的有效方法之一［1］。由于拉曼光譜對(duì)生物組織病理微小的分子和結(jié)構(gòu)的變化有很好的敏感性，很高的空間分辨率，不會(huì)導(dǎo)致自發(fā)熒光和光漂白作用，對(duì)水不敏感，樣品易準(zhǔn)備等特性，使得拉曼光譜技術(shù)能應(yīng)用于檢測(cè)人體組織結(jié)構(gòu)、生理或疾病狀況，從而在分子水平上預(yù)測(cè)、診斷人體的健康狀況(包括各種癌癥)已成為物理學(xué)家與醫(yī)學(xué)家夢(mèng)寐以求的愿望［2-5］。國(guó)內(nèi)外學(xué)者已廣泛開(kāi)展了拉曼光譜在人體組織，包括各種組織癌變［6-9］、血液［10-12］、皮膚疾?。?3-15］等的檢測(cè)與診斷。然而，由于各種生物組織具有高散射性，因此不利于對(duì)深層組織的成像，使得拉曼光譜技術(shù)只能用于淺表組織區(qū)域。

為了改善光在組織中的滲透深度，多重散射必須降低。在1997年俄羅斯Tuchin研究小組利用近紅外光譜儀檢測(cè)了光透明劑作用后眼球組織，發(fā)現(xiàn)光透明及對(duì)反射光強(qiáng)的減少起作用，進(jìn)而推斷光透明劑具有控制組織光學(xué)參數(shù)的作用［16］。隨后很多光學(xué)儀器被用來(lái)檢測(cè)光透明物質(zhì)對(duì)其光學(xué)特性的影響，例如:光學(xué)相干層析成像技術(shù)(Optical coherence tomography，OCT)［17，18］，二次諧波成像［19］，近紅外光譜技術(shù)［20］等。本論文采用光透明劑---二甲基亞砜對(duì)拉曼光譜光學(xué)特性的影響進(jìn)行研究。

1 材料和方法

1.1 材料和樣品的制備

新鮮豬皮組織(未去脂肪)來(lái)自合格的宰豬場(chǎng)，實(shí)驗(yàn)樣品經(jīng)蒸餾水清洗和除毛處理后，密封(防止自然失水)后保存在4℃的環(huán)境下不超過(guò)12 h，并在實(shí)驗(yàn)前將樣品置于常溫下30 min，然后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。為了防止皮膚組織樣品在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中自然失水導(dǎo)致皮膚形態(tài)和性質(zhì)發(fā)生變化，實(shí)驗(yàn)中皮膚組織保持表皮朝上置于培養(yǎng)皿中，并在培養(yǎng)皿中注入磷酸鹽(Phosphate buffer saline，PBS)緩沖液，使皮膚樣品下端浸入PBS緩沖液，同時(shí)表皮暴露在空氣中。共切15個(gè)面積為2.5 cm ×2.5 cm，平均厚度為(2.0 ±0.65)cm的組織，在處理前和處理后的10 min，20 min，30 min，60 min都利用顯微共聚焦拉曼光譜儀進(jìn)行檢測(cè)。

pH7.4 的 PBS溶液的配制:將 1.0 g KCl，40 g NaCl，1.2 g KH2PO4，18.16 g NaHPO4.12H2O(以上四種試劑均由天津市福晨化學(xué)試劑廠生產(chǎn))，溶于400mL雙蒸水中，并調(diào)至 pH7.4，最后定容至500mL，得到10×PBS母液。使用前稀釋10倍即得1×PBS溶液，置于室溫下保存?zhèn)溆谩?/p>

二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO，濃度為100%)是購(gòu)于天津市大茂化學(xué)試劑廠生產(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)選用的5%DMSO是按照100%DMSO與蒸餾水按體積5∶95的比例配制的。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

本實(shí)驗(yàn)選用Renishaw inVia Reflex型顯微共聚焦拉曼光譜儀(英國(guó)Renishaw公司)，20倍鏡頭，波長(zhǎng)為785 nm的半導(dǎo)體激光器作為激發(fā)光源，其到達(dá)樣品上的功率約50 mW，積分時(shí)間10 s，采集次數(shù)2次，光譜波數(shù)范圍為385～1539 cm-1，采用背向接收的方式采集樣品的拉曼信號(hào)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

采用Origin數(shù)據(jù)分析處理軟件及inVia Reflex型顯微拉曼光譜儀自帶的分析處理軟件WIRE3.2對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行累加處理及譜峰分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論

2.1 豬皮膚組織和DMSO的拉曼光譜

在圖1(A)中854 cm-1為脯氨酸吡硌環(huán)C-C鍵振動(dòng)峰，937 cm-1拉曼峰歸屬于豬皮組織中分子的C-C建骨架的伸縮振動(dòng)，1003 cm-1拉曼峰歸屬于豬皮組織中苯基苯丙氨酸等。圖1(B)為DMSO的拉曼光譜的譜圖，其主要特征峰有680 cm-1，為 C-S伸縮譜;1014 cm-1、1419 cm-1處分別為S-O伸縮譜和CH3的振動(dòng)譜，因?yàn)檫@兩個(gè)信號(hào)易受豬皮峰影響，而680 cm-1信號(hào)很強(qiáng)，因此之后我們對(duì)680 cm-1來(lái)觀察其在皮膚組織的滲透情況，以及對(duì)皮膚組織937 cm-1和1003 cm-1來(lái)觀察DMSO對(duì)皮膚組織的光透明性質(zhì)的變化。

Fig.1 (A)Raman spectrum of porcine skin;(B)DMSO between 395 and 1539 cm-1.The dashed lines indicate the spectral signatures for the porcine skin and the spectral signature for DMSO.680 cm-1is the most different spectral signature comparing DMSO with porcine skin圖1 (A)和(B)分別為豬皮組織和DMSO在385～1539 cm-1區(qū)域的譜圖，其中虛線標(biāo)注了皮膚的特征峰和DMSO，其中在(B)680 cm-1是DMSO與豬皮組織區(qū)別最大的特征峰

Fig.2 Raman spectra of porcine skin at(a)100μm，(b)200μm，(c)300μm，and(d)400μm after topically application of 5%DMSO at different time intervals圖2 離體豬皮膚組織經(jīng)5%DMSO處理前、后在不同時(shí)間(0 min，10 min，20 min，30 min，60 min)及不同深度(a)100μm，(b)200μm，(c)300μm，and(d)400μm 的拉曼光譜的變化

2.2 DMSO作用于離體豬皮膚組織前后的不同深度的拉曼光譜的變化

為了研究DMSO對(duì)豬皮組織拉曼光譜的影響及其隨時(shí)間的變化，我們對(duì)經(jīng)5%DMSO處理前(0 min)和后10 min，20 min，30 min，及60 min的豬皮不同深度(100μm，200μm，300μm，400μm)的拉曼光譜進(jìn)行比較(如圖2)。從圖中發(fā)現(xiàn)，總趨勢(shì)是:皮膚組織的拉曼光譜強(qiáng)度隨著檢測(cè)深度的增加而逐漸降低，信噪比也逐漸降低。在表面下400μm處0 min時(shí)，其拉曼信號(hào)強(qiáng)度非常小，圖像信噪比也很低，937 cm-1和1003 cm-1處的峰幾乎被熒光背景所覆蓋。在經(jīng)5%DMSO溶液處理之后，拉曼峰937 cm-1和1003 cm-1，的強(qiáng)度比處理前有了很大程度的改善，圖像信噪比也明顯提高了。此外，在沒(méi)有施加5%DMSO前在拉曼譜圖上消失拉曼峰1126 cm-1和1426 cm-1在施加5%DMSO后又重新出現(xiàn)。同時(shí)圖2(a-d)顯示，各層隨著處理時(shí)間的加長(zhǎng)，5%DMSO對(duì)豬皮組織的拉曼光譜的效果也不斷的改善，其中在處理后60 min時(shí)，是各層拉曼信號(hào)最強(qiáng)。

2.3 DMSO作用于離體豬皮膚組織前后在不同深度其幾個(gè)峰強(qiáng)的變化

為了更好的分析5%DMSO對(duì)豬皮組織的拉曼光譜的影響，我們對(duì)圖2進(jìn)行了進(jìn)一步的量化比較，統(tǒng)計(jì)了皮膚組織在施加5%DMSO前、后(10 min，20 min，30 min，60 min)時(shí)距皮膚表面以下不同深度處各個(gè)主要特征拉曼峰(680 cm-1，937 cm-1和1003 cm-1)強(qiáng)度的變化。圖3顯示:各層在經(jīng)5%DMSO處理后豬皮組織的各個(gè)峰及DMSO的特征峰的強(qiáng)度隨著時(shí)間的推移而不斷增強(qiáng)，并在60 min時(shí)強(qiáng)度達(dá)到最大。

Fig.3 The Raman peak intensities of porcine skin at(a)100μm，(b)200μm，(c)300μm，and(d)400μm corresponding to the Raman spectra in Fig.2，The line styles represents a characteristic peak of the DMSO(680 cm-1)and porcine skin Raman spectra(937 cm-1and 1003 cm-1)，respectively圖3 分別表示DMSO(680 cm-1)和豬皮組織(938 cm-1，1003 cm-1)的特征峰在與圖2相對(duì)應(yīng)的(a)100μm，(b)200μm，(c)300μm，and(d)400μm 不同層隨時(shí)間的變化情況

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)離體豬皮組織不同深度經(jīng)5%DMSO處理前、后不同時(shí)間的拉曼光譜進(jìn)行分析研究，以及對(duì)豬皮組織的拉曼光譜隨時(shí)間變化進(jìn)行了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)豬皮組織的拉曼光譜在處理后的60 min效果最好。結(jié)果表明:5%DMSO處理后的豬皮組織的拉曼光譜的信噪比有很大的提高，各特征峰的強(qiáng)度相對(duì)于處理前也有非常大的增強(qiáng)。這種增強(qiáng)效果幾乎是隨著施加5%DMSO的時(shí)間增加而加強(qiáng)。

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