電針治療對(duì)大鼠腦缺血再灌注中AnnexinA1和TRPM7表達(dá)的影響

鄭永強(qiáng) 葉 飛 劉南暖 鄧曉玲 汪 健 王成謀 上官守琴

瞬時(shí)感受器電位M7通道(TRPM7)是一種具有絲氨酸、蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的特殊的陽(yáng)離子通道蛋白。TRPM7的C端胞內(nèi)區(qū)的絲氨酸、蘇氨酸激酶可使自身和底物磷酸化，自身磷酸化發(fā)生在Ser1511和Ser1567兩個(gè)位點(diǎn)而關(guān)于該激酶的底物正在研究當(dāng)中。AnnexinA1是分子量約37KDa結(jié)構(gòu)相關(guān)的磷脂結(jié)合蛋白。AnnexinA1的氨基末端在 Thr24、Ser27、Ser28、Thr41有蛋白激酶C的磷酸化位點(diǎn)，Tyr21有表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶的磷酸化位點(diǎn)，在Ser5上有一個(gè)目前還只被一個(gè)具有離子通道功能和α激酶功能的蛋白質(zhì)瞬時(shí)感受器電位M7通道的α激酶磷酸化位點(diǎn)［1］。這些蛋白激酶磷酸化AnnexinA1后可以引起AnnexinA1功能上的一些改變。最近一項(xiàng)研究表明AnnexinA1分子N端的Ser5殘基可特異性地被TRPM7激酶磷酸化，而該部位磷酸化和AnnexinA1參與抗炎癥反應(yīng)，細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、調(diào)亡等功能相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)定動(dòng)物學(xué)習(xí)和記憶能力，免疫熒光雙標(biāo)方法檢測(cè)AnnexinA1和TRPM7在大鼠腦組織中的共存表達(dá)，旨在研究腦中風(fēng)發(fā)病的病理生理過(guò)程中探討電針穴位的效應(yīng)或作用;電針治療中對(duì)AnnexinA1與TRPM7共存為探討TRPM7在腦缺血再灌注損傷中的途徑提供理論依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 大腦中動(dòng)脈栓塞動(dòng)物模型的制備和評(píng)價(jià)

1.1.1 選用華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的健康成年雄性S－D大鼠，體重150～200g，隨機(jī)分組，每組8只:①正常對(duì)照組，②假手術(shù)組，③缺血再灌組:缺血再灌注24小時(shí)組，④電針治療組:缺血再灌注24小時(shí)+電針組。術(shù)前動(dòng)物禁食24小時(shí)。手術(shù)操作參照Longa［2］之方法，并稍加改進(jìn):10%水合氯醛(0.35ml/100g)腹腔注射麻醉動(dòng)物后，大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上。行大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞手術(shù):頸部正中切口，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)，用電熱燒灼器燒斷ECA的分支，結(jié)扎并游離ECA主干一段，沿ICA向下分離翼顎動(dòng)脈，穿線(xiàn)沿起點(diǎn)結(jié)扎。在ECA游離段上剪開(kāi)一小口，插入尖端用火燒圓的4.0單尼龍絲線(xiàn)，輕推尾端使之由頸外動(dòng)脈通過(guò)分叉部進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈(由入口計(jì)算長(zhǎng)度約18～20mm)，栓塞右大腦中動(dòng)脈(MCA)起始部從而減少大腦中動(dòng)脈血液供應(yīng)。1小時(shí)后緩慢退出尼龍線(xiàn)至頸外動(dòng)脈結(jié)扎端，恢復(fù)血供。手術(shù)結(jié)束后，縫合皮膚，將動(dòng)物放回籠中，保溫喂養(yǎng)。以4.0尼龍絲線(xiàn)栓塞右側(cè)大腦中動(dòng)脈60分鐘再灌注24小時(shí)后，大鼠均出現(xiàn)神經(jīng)缺損體征?？焖倨曙B取腦，肉眼可見(jiàn)缺血側(cè)大腦皮質(zhì)蒼白水腫，以2%TTC染色見(jiàn)缺血側(cè)皮質(zhì)梗死區(qū)呈蒼白色，對(duì)照側(cè)及非梗死區(qū)為紅色，紅白分明，極易鑒別。行為測(cè)試及形態(tài)學(xué)顯示均表明:用大腦中動(dòng)脈絲線(xiàn)栓塞法能得到理想的局灶性腦缺血模型。

1.1.2 以局灶性缺血區(qū)的TTC染色證實(shí)模型:TTC(triphenyl tetraxolium chloride)無(wú)色透明，對(duì)光、熱敏感，在線(xiàn)粒體過(guò)氧化氫酶的作用下，作為受氫體易被還原成紅色親脂性的四唑氮紅，因此，有線(xiàn)粒體存活的非梗死區(qū)腦組織染成紅色，無(wú)線(xiàn)粒體存活的缺血梗死區(qū)腦組織不能發(fā)生過(guò)氧化氫反應(yīng)而顯示蒼白色，二者界限清晰可辨.TTC染色可證實(shí)本實(shí)驗(yàn)栓線(xiàn)法腦缺血模型的可靠性。腦缺血再灌注后將大鼠斷頭處死，打開(kāi)顱骨蓋，剝?nèi)ツX膜，快速取出整個(gè)大腦，用PBS液清洗后，將鼠腦置于1%TTC溶液中，再于37℃ CO2孵育箱溫育20分鐘，嚴(yán)格避光，20分鐘后腦標(biāo)本移置于4%多聚甲醛液中固定。TTC染色后可見(jiàn)缺血區(qū)呈蒼白色，主要位于右側(cè)大腦背外側(cè)面額頂部的新皮層區(qū)，其余部位及左側(cè)大腦均呈紅色，表示供血狀況未發(fā)生改變。

1.1.3 電針條件選擇:選擇“水溝”、“承漿”穴，于缺血前30分鐘及缺血后30分鐘予以電針，使用TDM2A定量針麻治療儀(北京海淀電子醫(yī)療儀器廠制)，選擇間斷疏密波(頻率4～16Hz)，刺激強(qiáng)度從1V起，每10分鐘增加1V，終強(qiáng)度為3V，持續(xù)時(shí)共30分鐘。

1.2 大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)定動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力實(shí)驗(yàn)條件與儀器參照Morris水迷宮法［3］，實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)部分:定位航行實(shí)驗(yàn)和空間搜索實(shí)驗(yàn)。Morri水迷宮包括一個(gè)直徑120cm、高50cm盛有水的圓形水池、隱藏在水面下的平臺(tái)以及一套圖象自動(dòng)采集和處理系統(tǒng)(攝像機(jī)、錄像機(jī)、顯示器和分析軟件等)，水溫保持在26±1℃，水中加入奶粉，充分混勻，使水呈乳白色，致動(dòng)物視覺(jué)無(wú)法辨認(rèn)池內(nèi)有無(wú)站臺(tái)，不帶任何標(biāo)記，以池底圓心為中心將迷宮分為四個(gè)象限，平臺(tái)位于某一象限中心位置，注水后水面超過(guò)平臺(tái)2cm。

1.2.1 定位航行實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn):造模前3天對(duì)大鼠實(shí)施水迷宮訓(xùn)練，第一天讓大鼠自由游泳30秒以適應(yīng)環(huán)境，從第2天開(kāi)始，每天訓(xùn)練1次。訓(xùn)練時(shí)，按東北、西北、東南、西南4個(gè)象限依次將大鼠面向池壁放入水中，設(shè)定最長(zhǎng)游動(dòng)時(shí)間為120秒，觀察并記錄大鼠尋找并爬上平臺(tái)所需時(shí)間(逃避潛伏期)。如果大鼠在120秒內(nèi)未找到平臺(tái)，則將其引至臺(tái)，并將潛伏期記120秒。造模前1天進(jìn)行水迷宮測(cè)試，記錄大鼠找到平臺(tái)所用的時(shí)間，作為大鼠學(xué)習(xí)成績(jī)。第3天即造模結(jié)束后第1天再次測(cè)試各組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)找到平臺(tái)所需的時(shí)間，作為大鼠的記憶成績(jī)，連續(xù)5天。

1.2.2 空間探索實(shí)驗(yàn):定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后撤掉平臺(tái)，選定和平臺(tái)相對(duì)的象限中點(diǎn)為入水點(diǎn)，觀察大鼠在120秒內(nèi)跨越平臺(tái)所在位置的路徑和次數(shù)，記錄大鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)和搜尋平臺(tái)的軌跡。水迷宮實(shí)驗(yàn)持續(xù)7天。采用荷蘭noldus公司研制的Moris水迷宮檢測(cè)軟件系統(tǒng)自動(dòng)跟蹤池內(nèi)大鼠的活動(dòng)軌跡并記錄大鼠游泳時(shí)間、穿越平臺(tái)次數(shù)等參數(shù)。行為學(xué)檢測(cè)期間，保持室內(nèi)安靜。

1.3 Annexin A1和TRPM7免疫組織化學(xué)

1.3.1 主要試劑:Mouse anti－AnnexinA1單克隆抗體，Santa Cruz公司生產(chǎn);Goat anti－TRPM7多克隆抗體，Novus Biologicals公司生產(chǎn);抗mouse免疫組化試劑盒，武漢博士德提供;FITC－conjugated affinipure Donkey Anti－mouse IgG(USA)和 Texas red－conjugated affinipure Donkey Anti－goat IgG(USA)均由武漢眾一公司提供。

1.3.2 腦片制備:大鼠在腦缺血60分鐘再灌注24小時(shí)后經(jīng)10%水合氯醛腹腔麻醉(350mg/kg)，開(kāi)胸經(jīng)左心室行主動(dòng)脈插管，剪開(kāi)右心耳，以250ml生理鹽水經(jīng)升主動(dòng)脈快速?zèng)_洗。隨后灌注預(yù)冷的4℃的4%多聚甲醛固定液450ml，斷頭取腦后組織修塊，再將大腦后固定于4℃的4%多聚甲醛固定液中，固定6小時(shí)后，腦組織經(jīng)振蕩切片機(jī)連續(xù)冠狀切片，片厚20μm，收集于0.01mol/L PBS溶液(pH=7.4)中備用。

1.3.3 免疫熒光雙標(biāo)方法:取腦片0.01Mol/LPBS(pH:7.4)充分漂洗10分鐘×3次，0.3%Triton 37℃恒溫箱孵育30min，0.01Mol/L PBS充分漂洗10min×3次，5%BSA在室溫(20～24℃)下孵育30分鐘，吸干BSA后加入anti－mouse單克隆Annexin A1抗體(工作濃度為1∶25)，anti－goat多克隆TRPM7抗體(工作濃度為1∶25)，5%BSA混合液，放置4℃冰箱，孵育32小時(shí)，再置37℃恒溫箱60分鐘，0.01mol/L PBS(pH=7.4)充分漂洗10min×3次，加FITC－conjugated affinipure Donkey Anti－mouse IgG(USA)(工作濃度為1∶100)和Texas red－conjugated affinipure Donkey Anti－goat IgG(工作濃度為1∶100)，5%BSA混合液，室溫孵育60分鐘，再37℃恒溫箱孵育45分鐘，0.01Mol/LPBS(pH:7.4)充分漂洗10分鐘×3次，激光共聚焦照相。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中以PBS代替一抗作空白對(duì)照

1.3.4 圖像分析和統(tǒng)計(jì)處理 每組動(dòng)物隨機(jī)取3張切片，每張切片選取海馬CA1，CA3和皮質(zhì)區(qū)在20×10倍下用激光共聚焦分析系統(tǒng)對(duì)其免疫反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行圖像錄入后，分別計(jì)數(shù)每一個(gè)視野(4，000，000μm2)中 CA1，CA3和皮質(zhì)區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞核和膜上陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)。所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0系統(tǒng)做方差分析和t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)處理，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，并以單因素方差分析，P＜0.05有顯著差異。

2.結(jié)果

2.1 電針治療可顯著改善缺血再灌注后大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力檢測(cè)結(jié)果

2.1.1 定位航行實(shí)驗(yàn):如表1所示，定位航行實(shí)驗(yàn)中各組大鼠逃避潛伏期隨訓(xùn)練次數(shù)的增多在不斷縮短。各組在第1天顯示出較強(qiáng)的學(xué)習(xí)能力，造模后缺血再灌組學(xué)習(xí)能力顯著下降，電針治療組與缺血再灌組相比學(xué)習(xí)能力均顯著提高(P＜0.05)。說(shuō)明電針可提高大鼠的學(xué)習(xí)能力。

表1 各組大鼠定位航行試驗(yàn)中平均逃避潛伏期的比較(n=8，±s)

表1 各組大鼠定位航行試驗(yàn)中平均逃避潛伏期的比較(n=8，±s)

組別 第1天 第3天 第4天 第5天 第6天 第7天正常對(duì)照組 85.03±33.86 75.14±28.80 60.13±16.32 46.85±17.46 30.45±12.36 23.48±15.46假手術(shù)組 86.12±32.98 78.04±25.79a 61.28±23.16b 48.79±14.24 34.68±13.46 25.12±13.89缺血再灌組 85.35±33.76 108.26±30.12b 96.36±28.20 83.90±24.68b 60.87±20.12 45.36±25.12電針治療組 85.98±32.26 97.58±28.85 90.45±30.16 76.24±39.44 50.43±23.65 30.26±23.16

2.1.2 空間探索實(shí)驗(yàn):如表2所示，在定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后撤除平臺(tái)，正常對(duì)照組、假手術(shù)組和電針治療組大鼠搜尋目標(biāo)的目的性較強(qiáng)，造模后在規(guī)定時(shí)間(120秒)內(nèi)搜尋并穿越平臺(tái)次數(shù)明顯高于缺血再灌組，其中電針治療組與缺血再灌組結(jié)果有顯著性差異(P＜0.01)，說(shuō)明電針能有效改善大鼠的記憶功能。

表2 各組大鼠空間探索試驗(yàn)中穿越平臺(tái)的次數(shù)(n=8，±s)

表2 各組大鼠空間探索試驗(yàn)中穿越平臺(tái)的次數(shù)(n=8，±s)

組別 第1天 第3天 第7天正常對(duì)照組 1.00±0.61 2.00±0.55 3.63±0.45假手術(shù)組 1.00±0.59 1.86±0.75 3.12±0.98a缺血再灌組 1.00±0.60 1.06±0.24 1.60±0.65b電針治療組1.00±0.62 1.71±0.48 2.48±1.08

2.2 免疫熒光雙標(biāo)方法檢測(cè)AnnexinA1和TRPM7在大鼠腦組織中的共存表達(dá)結(jié)果 腦缺血再灌注后再進(jìn)行電針治療，①在海馬CA1，CA3，皮質(zhì)區(qū)，腦缺血再灌組與正常對(duì)照組相比，Annexin A1和TRPM7共存表達(dá)升高分別是48.06%，50.19%，30.07%(P＜0.05);②電針治療組與腦缺血再灌組相比，Annexin A1和 TRPM7共存表達(dá)水平下降分別是34.88%，47.80%，41.96%(P＜0.05)。經(jīng)激光共聚焦的圖像顯示AnnexinA1和TRPM7蛋白共存表達(dá)及分布，分別計(jì)數(shù)每一個(gè)視野(4，000，000um2)中 CA1，CA3和皮質(zhì)區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。結(jié)果①在海馬CA1區(qū)，正常對(duì)照組、缺血再灌組、電針治療組Annexin A1和TRPM7共存表達(dá)平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為16.75±0.0189、32.25±0.0442、21，10±0.0316;②在海馬CA3區(qū)，正常對(duì)照組、缺血再灌組、電針治療組AnnexinA1和TRPM7共存表達(dá)平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為20.05±0.0420、39.25±0.0262、20.75±0.0221;③在皮質(zhì)區(qū)，正常對(duì)照組、缺血再灌組、電針治療組AnnexinA1和TRPM7共存表達(dá)平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為 25.00±0.0509、35.75±0.0591、20.75±0.2501。結(jié)果提示:①在腦缺血再灌注損傷中有可能TRPM7的α蛋白激酶磷酸化AnnexinA1后可以引起AnnexinA1功能上的一些改變;②電針對(duì)AnnexinA1和TRPM7異常表達(dá)的調(diào)節(jié)也可能通過(guò)同一途徑。(如表3、圖1～圖3所示)

表3 電針治療對(duì)缺血再灌注后AnnexinA1和TRPM7共表達(dá)的影響

圖1 AnnexinA1和TRPM7共表達(dá)在海馬CA1區(qū)共表達(dá)變化

圖2 AnnexinA1和TRPM7共表達(dá)在海馬CA3區(qū)共表達(dá)變化

圖3 Annexin A1和TRPM7共表達(dá)在皮質(zhì)區(qū)共表達(dá)變化

3.討論

腦缺血再灌注損傷是指機(jī)體器官缺血一定時(shí)間后再恢復(fù)血流灌注，組織損傷反而進(jìn)行性加重的病理生理過(guò)程。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注使神經(jīng)元產(chǎn)生損傷是一個(gè)快速的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，這個(gè)級(jí)聯(lián)反應(yīng)包括許多環(huán)節(jié)，如能量障礙、細(xì)胞酸中毒、興奮性氨基酸釋放增加、N－甲基－D－天冬氨酸受體的過(guò)度激活、細(xì)胞內(nèi)鈣失穩(wěn)態(tài)、自由基生成、凋亡基因激活等。這些環(huán)節(jié)互為因果，彼此之間相互關(guān)聯(lián)、相互影響，最終通過(guò)多種因素共同作用導(dǎo)致神經(jīng)元損傷。電針治療腦中風(fēng)有助于保護(hù)神經(jīng)元，減少神經(jīng)元凋亡而改善預(yù)后，對(duì)于探討針灸治療神經(jīng)元凋亡機(jī)制提供新的途徑。

海馬是大腦對(duì)缺血、缺氧損傷最敏感的組織。由于海馬CA1區(qū)與大鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能有著密切的關(guān)系，因而用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)腦缺血后大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能的改變。神經(jīng)細(xì)胞受到損傷，引起機(jī)能障礙，進(jìn)而可使神經(jīng)退變，學(xué)習(xí)記憶能力減退［4］。用定位航行實(shí)驗(yàn)主要以找到平臺(tái)所用時(shí)間(逃避潛伏期)來(lái)衡量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的學(xué)習(xí)能力，空間探索實(shí)驗(yàn)以穿越原平臺(tái)次數(shù)(記憶頻度)考察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的記憶能力。本次實(shí)驗(yàn)水迷宮測(cè)試歷時(shí)7天，定位航行實(shí)驗(yàn)中各組大鼠逃避潛伏期隨訓(xùn)練次數(shù)的增多在不斷縮短。各組在第1天顯示出較強(qiáng)的學(xué)習(xí)能力，造模后缺血再灌組學(xué)習(xí)能力顯著下降，電針治療組與缺血再灌組相比學(xué)習(xí)能力均顯著提高，說(shuō)明電針可提高大鼠的學(xué)習(xí)能力。在定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后撤除平臺(tái)，正常對(duì)照組、假手術(shù)組和電針治療組大鼠搜尋目標(biāo)的目的性較強(qiáng)，造模后在規(guī)定時(shí)間(120秒)內(nèi)搜尋并穿越平臺(tái)次數(shù)明顯高于缺血再灌組，其中電針治療組與缺血再灌組結(jié)果有顯著性差異，說(shuō)明電針能有效改善大鼠的記憶功能，提示電針有可能通過(guò)降低CA1區(qū)AnnexinA1和TRPM7表達(dá)，影響了大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

近年來(lái)TRPM7的結(jié)構(gòu)、功能、其通道活性的調(diào)節(jié)、其絲氨酸、蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的底物及TRPM7與各種疾病的關(guān)系已成為研究熱點(diǎn)。TRPM7是一種具有絲氨酸、蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的特殊的陽(yáng)離子通道蛋白。在大腦，TRPM7已被發(fā)現(xiàn)存在于海馬和皮層神經(jīng)元以及小膠質(zhì)細(xì)胞中［5］。對(duì)大鼠和人TRPM7的研究表明，TRPM7是由7105個(gè)堿基對(duì)的轉(zhuǎn)錄物編碼的含1863個(gè)氨基酸的的多肽鏈。其C端約347個(gè)氨基酸為絲氨酸、蘇氨酸激酶區(qū)(accession number:AF149013)。該激酶區(qū)屬于α－激酶家族成員，在氨基酸序列上與經(jīng)典的絲氨酸、蘇氨酸激酶不具同源性。此外，TRPM7的激酶區(qū)還含有與磷酸脂酶C－β及磷酸脂酶C－γ的C2結(jié)構(gòu)域結(jié)合的區(qū)域。TRPM7的C端胞內(nèi)區(qū)的絲氨酸、蘇氨酸激酶可使自身和底物磷酸化，自身磷酸化發(fā)生在Ser1511和Ser1567兩個(gè)位點(diǎn)而關(guān)于該激酶的底物正在研究當(dāng)中。

AnnexinA1是分子量約37KDa結(jié)構(gòu)相關(guān)的磷脂結(jié)合蛋白。膜上有高度保守的C－末端序列，由四個(gè)重復(fù)70個(gè)氨基酸組成。每個(gè)AnnexinA1的N－末端由44個(gè)氨基酸組成，含有蛋白激酶C、酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)，以及糖基化、乙酰化和蛋白酶水解位點(diǎn)。AnnexinA1的氨基末端在 Thr24、Ser27、Ser28、Thr41有蛋白激酶C的磷酸化位點(diǎn)，Tyr21有表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶的磷酸化位點(diǎn)，在Ser5上有一個(gè)目前還只被一個(gè)具有離子通道功能和α激酶功能的蛋白質(zhì)TRPM7的α激酶磷酸化位點(diǎn)［1］。我們前期研究表明局灶性腦缺血再灌注損傷可誘導(dǎo)大鼠海馬和皮層組織TRPM7的表達(dá)水平增加，而且電針治療可抑制TRPM7的高表達(dá)［6］。某些蛋白激酶磷酸化AnnexinA1后可以引起AnnexinA1功能上的一些改變。最近一項(xiàng)研究表明AnnexinA1分子N端的Ser5殘基可特異性地被TRPM7激酶磷酸化，而該部位磷酸化和AnnexinA1參與抗炎癥反應(yīng)，細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、調(diào)亡等功能相關(guān)。有研究還顯示，AnnexinA1在腦缺血再灌注中發(fā)揮著保護(hù)作用。但眾多的資料顯示AnnexinA1蛋白也介導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注后AnnexinA1和TRPM7在海馬和皮質(zhì)明顯表達(dá)上升;電針治療后AnnexinA1和TRPM7的表達(dá)下降，提示AnnexinA1和TRPM7可能在腦缺血再灌注中不同部位發(fā)揮保護(hù)或損傷作用。海馬是大腦內(nèi)對(duì)缺血缺氧損傷最敏感的組織而且富含神經(jīng)生長(zhǎng)因子，在缺血缺氧條件下，神經(jīng)生長(zhǎng)因子可以通過(guò)激活靶細(xì)胞上的TrkA受體抑制TRPM7的高表達(dá)，減少TRPM7通道的數(shù)量，從而減少TRPM7對(duì)神經(jīng)元的損傷。TRPM7是具有離子通道和α蛋白激酶雙重功能的蛋白質(zhì)，TRPM7的α蛋白激酶能夠在Ser5上磷酸化AnnexinA1，引起AnnexinA1生物學(xué)功能的改變。在本實(shí)驗(yàn)研究中我們發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注后AnnexinA1和TRPM7的共表達(dá)上調(diào)，經(jīng)電針治療后AnnexinA1和TRPM7的共表達(dá)下調(diào)，提示電針治療Annexin A1的表達(dá)調(diào)控可能是神經(jīng)生長(zhǎng)因子可以通過(guò)激活靶細(xì)胞上的TrkA受體抑制TRPM7的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控AnnexinA1的表達(dá)。AnnexinA1的轉(zhuǎn)位被認(rèn)為是TRPM7的活化指標(biāo)［7］。有研究顯示:在遺傳性鎂血癥的小鼠隨著TRPM7的底物AnnexinA1表達(dá)的減少，鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)體TRPM7的血管表達(dá)增加［8］，磷酸化的AnnexinA1調(diào)節(jié)生成血管的效應(yīng)是通過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子與p38/LIM激酶1軸的活化有關(guān)［9］。人胚腎母細(xì)胞瘤系293細(xì)胞TRPM7的超表達(dá)擴(kuò)大在急性缺血缺糖和化學(xué)性缺血1小時(shí)后基礎(chǔ)水平和增加的鎂離子濃度，這暗示在大鼠海馬神經(jīng)元缺氧誘導(dǎo)鎂離子濃度的增加是經(jīng)TRPM7 通道［10］。

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